溶菌酶的提取分離和純化實(shí)驗(yàn)報(bào)告

生物工程綜合實(shí)驗(yàn)溶菌酶的提取、別離純化及其活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)報(bào)告集班級(jí)生工1411學(xué)號(hào)一組別_7蘇州科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物上程綜合實(shí)驗(yàn)離周期短、洛菌酶純度高。但山于各個(gè)實(shí)驗(yàn)的要求比擬嚴(yán)格，所制得的洛菌酶過(guò)程中易因?yàn)楦鞣N原因而受到損失，實(shí)驗(yàn)誤差比擬大，因此還需要繼續(xù)研究更為適合規(guī)?；a(chǎn)，提取純度更高的方法。參考文獻(xiàn)[1]陳鈞輝主編？生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)?第四版[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào)，2003,(zl):10-14.D01:10.3969/j.issn.1009-7848.2003.zl.003.[J].食品研究與開(kāi)發(fā),2021,29(1):182-185.D01:10.3969/j.issn.1005-6521.2021.01.057.[M].開(kāi)封：河南大學(xué)出版社[J].廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)，2003,19(4):356-358.D01:10.3969/j.issn.1006-8783.2003.04.025.[J].食品科學(xué),1994(3)姓名一實(shí)驗(yàn)室學(xué)生守那么一、嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)室各項(xiàng)規(guī)章制度和管理措施，服從教師及實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員的指導(dǎo)。二、嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)要求，做好實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)，實(shí)驗(yàn)之前5分鐘進(jìn)入實(shí)驗(yàn)室，及時(shí)、

準(zhǔn)確地完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，實(shí)事求是地完成實(shí)驗(yàn)報(bào)告，杜絕弄虛作假。三、嚴(yán)格執(zhí)行操作規(guī)定，保護(hù)儀器設(shè)備及工具。凡不按教師的指導(dǎo)擅自操作引起儀器、設(shè)備損壞者，應(yīng)予賠償。四、保護(hù)實(shí)驗(yàn)室公共財(cái)物，節(jié)約水電、材料和試劑。未經(jīng)允許不得隨便挪動(dòng)非實(shí)驗(yàn)需用的其他儀器，不得隨便拆裝儀器或?qū)x器、工具帶至室外。五、持實(shí)驗(yàn)室的嚴(yán)肅安靜，不得大聲喧嘩、嘻鬧，嚴(yán)禁在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)抽煙和吃東西。六、嚴(yán)防事故，確保實(shí)驗(yàn)室平安，發(fā)現(xiàn)異常情況，應(yīng)及時(shí)向有關(guān)教師和管理人員報(bào)告。七、每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，主動(dòng)整理好儀器設(shè)備，歸還所借器材，關(guān)閉電源、水源，按指導(dǎo)老師的要求做好實(shí)驗(yàn)結(jié)束工作及室內(nèi)外的清潔衛(wèi)生工作，經(jīng)指導(dǎo)老師許可后，方可離開(kāi)。名稱溶菌酶的提取、別離純化及其活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?實(shí)驗(yàn)材料：主要儀器：主要步驟：預(yù)習(xí)報(bào)告〔手寫，可自行續(xù)頁(yè)）教師簽名：時(shí)間:蘇州科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物I:程綜合實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)告溶菌酶的提取、別離純化及其活性測(cè)定一、目的對(duì)從雞蛋清中提取并別離純化出洛菌酶進(jìn)行活性測(cè)定二、原理雞蛋是溶菌酶的主要來(lái)源，等電點(diǎn)約為10.5-11,最適溫度50P,最適pH為6~7左右。1、溶菌酶別離純化原理：〔1〕 等電點(diǎn)法利用溶菌酶等電點(diǎn)較高，在酸性條件下除去一些雜蛋口[2) 陽(yáng)離子樹(shù)脂柱層析法進(jìn)一步除去雜蛋白2、溶菌酶鑒定分析[1) 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋口含量12) 分光光度法測(cè)定酶活性(3)使用SDS鑒定溶菌酶純度三、實(shí)驗(yàn)材料與方法1、實(shí)驗(yàn)材料與試劑雞蛋清，PBS緩沖液，40%甘油'冰醋酸'氫氧化鈉，D152大孔弱酸性陽(yáng)離子交換樹(shù)脂、透析袋，考馬斯亮藍(lán)G250、牛血清蛋白,乙醇,磷酸，溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)品、底物微球菌粉，蛋口質(zhì)分子量Marker、SDS、聚乙二醇-20000等2、實(shí)驗(yàn)儀器低速離心機(jī)、高速冷凍離心機(jī)、離心管、分光光度計(jì)，玻璃層析柱，Bio-Rad垂直電泳系統(tǒng)，移液槍、移液管，培養(yǎng)皿'玻璃棒'普通漏斗'濾紙、量筒、刻度試管及試管架'冰箱'搖床'燒杯'止水夾等。3、實(shí)驗(yàn)方法.新鮮雞蛋清的制備與粗別離.樹(shù)脂柱層析別離純化D152樹(shù)脂處理(2)濕裝法裝柱(3〕上柱離子交換吸附(4)沖平(5〕洗脫.透析與濃縮.蛋白質(zhì)含量的測(cè)定.溶菌酶純度的測(cè)定（SDS凝膠電泳〕1?蛋白濃度實(shí)驗(yàn)結(jié)果[1）蛋口質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制管號(hào)123456標(biāo)準(zhǔn)蛋白液（inL）0蒸憾水（mLJ0考馬斯亮藍(lán)〔mL〕444444蛋白質(zhì)含量（pg/mL）020406080100OD5950OD595[2）待測(cè)樣品蛋口濃度測(cè)定管號(hào)ElE2E3E4蛋白質(zhì)待測(cè)樣品提取液1mL）0.10.10.10.1蒸懈水（mL）考馬斯亮藍(lán)（mL）4444OD5952.3740.0380.972蛋白質(zhì)含量lug/mLJ244.07101.880.7498.03蘇州科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物上程綜合實(shí)驗(yàn)分析：山圖中數(shù)據(jù)與制作的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品比擬可知，經(jīng)過(guò)處理后，EI,E2的蛋口質(zhì)的含量的數(shù)值急劇下降，到E3已經(jīng)兒乎趨于0,可說(shuō)明溶菌酶粗提取的過(guò)程中已經(jīng)除去了大量的雜蛋白，得到了進(jìn)一步別離純化后的蛋白質(zhì)。2、酶活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶活力測(cè)定結(jié)果時(shí)間AOsAISOs蘇州科技大學(xué)生物實(shí)驗(yàn)中心學(xué)生實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物上程綜合實(shí)驗(yàn)分析：山圖中數(shù)據(jù)與制作的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的樣品比擬可知，經(jīng)過(guò)處理后，EI,E2的蛋口質(zhì)的含量的數(shù)值急劇下降，到E3已經(jīng)兒乎趨于0,可說(shuō)明溶菌酶粗提取的過(guò)程中已經(jīng)除去了大量的雜蛋白，得到了進(jìn)一步別離純化后的蛋白質(zhì)。2、酶活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果酶活力測(cè)定結(jié)果時(shí)間AOsAISOs酶的活力單位數(shù)E10.6820.62519E20.6250.585E30.6850.6618E10.8220.53795根據(jù)實(shí)驗(yàn)所得的E1~E4各樣品，匯總結(jié)果如下表所示樣品E1體積向 蛋白濃度總蛋白酶活力比活力總活力U 回收率％ 提純倍數(shù)mg/mlmg u/ml u/mg31 100% 1E2E3E495100.5%399 22.4%分析：山上述數(shù)據(jù)可知，吸光度值總體呈下降趨勢(shì)，且隨著時(shí)間的推移，在朵蛋口提純后，樣品E4的酶活力和比活力較先前的E1和E2有了極大的增長(zhǎng)，說(shuō)明經(jīng)過(guò)提純后，所需要的酶活性增加，但總活力下降，說(shuō)明溶菌酶的純度比擬好。分析:聚丙烯酰胺凝膠電泳可根據(jù)不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的差異及不同遷移率將蛋白質(zhì)別離成假設(shè)干條區(qū)帶，如果別離純化的樣品中只含有同一種蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)樣品電泳后，就應(yīng)只別離出一條區(qū)帶。SDS能夠和蛋口質(zhì)分子結(jié)合成復(fù)合物，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異，各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物在電泳時(shí)的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，只與分子量有關(guān)，這種方法常用來(lái)鑒定蛋白質(zhì)別離樣品的純化程度。根據(jù)以上原理和上述圖片，可觀察到，本組所在的11-15泳道，11泳道為標(biāo)準(zhǔn)品，15泳道為樣品E1J2到14泳道依次為樣品E3,E3,E4,由于人為操作問(wèn)題導(dǎo)致12-15泳道的結(jié)果不是特別清晰，但是仍然能比擬蛋白質(zhì)分子量的大小。4、回收率與提純倍數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品體積向 蛋白濃度悲蛋白 酶活力 比活力 總活力U 回收率％提純倍數(shù)mg/ml mg u/ml u/mgE131 100% 1E2100.5%E3- - 8 - - -E495 399 22.4%分析：從E1到E4階段，回收率下降，提純倍數(shù)升高，說(shuō)明在提純過(guò)程中由于人為操作問(wèn)