免檢器官移植及免疫學檢驗（免疫學檢驗課件）

器官移植及免疫學檢驗器官移植的基本知識。HLA的分型技術(shù)。組織配型和免疫抑制措施。移植后的免疫學監(jiān)測內(nèi)容。誘導同種異體免疫耐受和研究異種移植。器官移植的基本知識1HLA分型技術(shù)2預防移植排斥反應的免疫學措施3移植后的免疫監(jiān)測4器官移植面臨的主要問題和解決方案設想5

自1954年美國波士頓醫(yī)生默里成功地進行了世界上第一例同卵雙胞胎之間的移植手術(shù)至今，器官移植經(jīng)歷了理論、技術(shù)及倫理等的考驗，逐步成熟并為越來越多的人們所接受。當前臨床上廣泛開展的有：角膜、皮膚、肝、腎、心臟、骨髓等移植，器官移植已成為治療各種臟器和造血系統(tǒng)終末期疾病唯一的手段。

指應用異體或自體正常器官、組織、細胞置換病變或功能缺損的器官、組織、細胞，以維持和重建機體生理功能的治療方法。移植物供體受體第一節(jié)器官移植的基本知識一、移植的概念自體移植（autograft）同系移植/同基因移植（syngraft）同種（異體/異基因）移植（allograft）異種移植（xenogeneicgraft）二、移植的類型是指移植后，受者免疫系統(tǒng)識別移植物抗原或移植物中免疫細胞識別受者抗原，產(chǎn)生免疫應答，導致移植物功能喪失或受者機體損害的過程。三、移植排斥反應

主要組織相容性抗原（MHA）

次要組織相容性抗原（mHA）

ABO血型抗原系統(tǒng)組織特異性抗原（一）誘導移植排斥反應的抗原1、主要組織相容性抗原（MHA）

HLA-DRHLA-A、HLA-B、HLA-DQ和HLA-DP，HLA-C在進行個體移植是，引起移植排斥反應最強的是HLA。在三類HLA中，I、II類分子是引發(fā)移植排斥反應的首要抗原，尤其是HLA－DR位點的抗原分子。2、次要組織相容性抗原（mHA）

排斥反應的程度輕，速度慢

性染色體編碼的mHA

常染色體編碼的mHA

3、人類紅細胞血型抗原

ABO血型系統(tǒng)(供受者必須一致！）

Rh血型系統(tǒng)4、組織特異性抗原血管內(nèi)皮細胞特異性抗原、腎特異性抗原、肝臟特異性抗原、骨髓特異性抗原等。

（二）T細胞識別同種異型抗原的機制1．細胞免疫應答效應2.體液免疫應答效應3．非特異性免疫應答效應

（三）移植排斥反應的效應機制

供體移植物的抗原可被受體免疫系統(tǒng)識別，介導宿主抗移植物反應（hostversusgraftrejection,HVGR），另一方面受者組織抗原也可刺激移植物中的免疫細胞，誘導免疫應答，引起移植物抗宿主反應（graftversushostrejection,GVHR)。

（四）移植排斥反應的類型根據(jù)排斥反應發(fā)生的時間強度、發(fā)病機理、臨床表現(xiàn)及病理變化，分為：超急性排斥反應急性排斥反應慢性排斥反應1、宿主抗移植物反應（HVGR）（1）超急性排斥反應（hyperacuterejection）

是指血管接通后數(shù)分鐘至術(shù)后1~2天內(nèi)發(fā)生的不可逆轉(zhuǎn)的體液排斥反應，常見于反復輸血、多次妊娠或再次移植的個體，其發(fā)生機制與供受者間血型不合、受者血液中預存有抗供者的抗體（包括ABO和Rh抗體，HLA抗體等）有關(guān)。

為同種異體移植中最常見的排斥反應類型，一般在術(shù)后幾天至2周左右出現(xiàn)，約80%~90%在術(shù)后1個月內(nèi)出現(xiàn)。其發(fā)生機制主要為細胞免疫，通常急性排斥反應發(fā)生越早越嚴重，后期發(fā)生的排斥反應有體液免疫的參與，多數(shù)進展緩慢，癥狀較輕。（2）急性排斥反應（acuterejection）（3）慢性排斥反應（chronicrejection）

指發(fā)生于術(shù)后數(shù)月至數(shù)年的緩慢、進行性、不可逆，并最終導致移植物功能喪失的排斥反應，其特點主要是正常組織結(jié)構(gòu)的喪失和纖維化，血管平滑肌細胞增生，移植物血管的破壞。慢性排斥反應的機制尚未完全清楚，目前認為由免疫和非免疫兩種機制引起。

當移植物存活后，移植物中的免疫活性細胞（主要是T細胞）識別宿主抗原，誘導免疫應答，攻擊受者靶組織的一種排斥反應，常在骨髓（造血干細胞）移植或其他免疫細胞移植（如脾臟、胸腺移植）中發(fā)生。

移植物抗宿主?。℅VHD）2、移植物抗宿主反應(GVHR）

GVHR的發(fā)生條件①移植物中有大量免疫活性細胞②宿主和移植物組織相容性抗原不符③宿主處于免疫功能極度低下狀態(tài)，沒有能力對移植物發(fā)動HVGR血清學分型細胞學分型基因分型

第二節(jié)HLA分型技術(shù)SD抗原

HLA-ABCHLA-DRDQ補體依賴的細胞毒(CDC)試驗一、HLA血清學分型技術(shù)

將待檢淋巴細胞與一系列已知抗HLA標準分型血清混合后，抗體會特異性結(jié)合表達相應HLA抗原的淋巴細胞，在補體的作用下，引起細胞死亡，死亡的細胞可被臺盼藍等染料染色，而活細胞由于細胞膜完整不著色，根據(jù)死亡細胞的百分比，判定其HLA的型別。CDC試驗原理流式細胞儀分析技術(shù)LD抗原

HLA-D和DP

混合淋巴細胞培養(yǎng)(MLC)二、HLA細胞學分型技術(shù)

兩個基因型不同個體的淋巴細胞，在體外進行混合培養(yǎng)時，由于彼此的HLA不同，能相互刺激導致雙方淋巴細胞活化增殖和分化，進而表現(xiàn)形態(tài)學的變化和細胞的增殖，可通過形態(tài)學或3H-TdR滲入試驗來檢測淋巴細胞反應的強度，從而判定其HLA型別。

單向MLC和雙向MLCMLC原理RFLP:限制性片段長度多態(tài)性分析PCR-SSOP：序列特異性寡核苷酸探針-PCRPCR-SSP：序列特異性引物-PCRPCR-SSCP：單鏈構(gòu)象特異性-PCRSBT分型法：基于序列的HLA分型法多熒光微珠免疫分析基因芯片三、HLA基因分型技術(shù)

不同個體間的HLA復合體存在核苷酸堿基序列的差異，這種差異造成限制性內(nèi)切酶識別位置及酶切位點數(shù)目的不同，用一組限制性內(nèi)切酶消化、識別、切割這些位點，產(chǎn)生數(shù)量和長度不一的DNA酶解片段，經(jīng)瓊脂糖電泳或用特異性探針與酶解片段進行雜交即可確定HLA的基因型別。也可先對DNA片段進行體外PCR擴增，然后再進行RFLP分析，即PCR-RFLP。PCR-RFLP

先對HLA基因片段進行PCR擴增，然后將擴增片段轉(zhuǎn)移至NC膜或尼龍膜上，然后與用放射性核素或酶、地高辛等標記的寡核苷酸探針進行雜交，若待檢DNA與探針序列互補，則兩者結(jié)合，從而確定HLA的基因型別。PCR-SSOP

根據(jù)各型別HLA核苷酸堿基序列差異，設計出一套HLA等位基因的序列特異性引物，對待測DNA進行PCR擴增，因TaqDNA聚合酶沒有3′→5′核酸內(nèi)切酶活性，引物3′端最后一個堿基是否與模板配對決定著能否擴增出產(chǎn)物。若將引物的3′端最后一個堿基設計在正好有差異的那個堿基序列上，則擴增產(chǎn)物僅需常規(guī)瓊脂糖電泳，根據(jù)特異產(chǎn)物存在與否即可直接對HLA進行分型。

用PCR擴增特定的靶序列,經(jīng)變性使之成為兩條單鏈,然后在無變性劑的中性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。單鏈DNA如果存在堿基差異,即使一個堿基的不同,也會表現(xiàn)出電泳遷移率的不同,據(jù)此可將不同型別的HLA區(qū)分開,達到分型的目的。PCR-SSCP

首先用PCR擴增HLA的DNA片段，擴增產(chǎn)物進行純化和測序，將此序列與HLA基因庫的DNA已知序列進行比較，即可獲得HLA的基因型別。最可靠也最徹底的基因分型方法。

用標記有生物素的特異性引物分別擴增HLA-A、B、DR等基因座位的特異性片段，擴增產(chǎn)物與已知的寡核苷酸探針（事先包被在不同顏色的磁珠上）進行雜交，洗脫沒有結(jié)合的DNA片段，再與熒光素標記的親和素結(jié)合，多熒光微珠在流式細胞儀上進行結(jié)果判讀，若擴增的DNA片段能與探針結(jié)合則發(fā)熒光，不結(jié)合則無熒光。多熒光微珠免疫分析

首先用PCR擴增獲得HLA的DNA片段，用放射性核素或熒光素標記擴增的DNA分子，再與預先點在固相支持物表面的成千上萬個代表不同基因的寡核苷酸探針進行雜交，通過放射自顯影或熒光檢測，雜交結(jié)果通過計算機軟件處理分析后獲得雜交信號的強度及分布模式圖，從而反映樣品中HLA的基因型別。基因芯片移植前組織配型免疫抑制措施第三節(jié)預防移植排斥反應的免疫學措施供受者HLA是否相符是移植物存活的主要條件之一，兩者的匹配程度決定了移植排斥反應的強弱。HLA系統(tǒng)含有多種Ⅰ類和Ⅱ類抗原基因，但多數(shù)情況下只檢測HLA-DR、A和B。不同器官的移植對HLA配型要求不同。一、組織配型（一）HLA配型ABO血型必須相同或相容?。。ǘ┘t細胞血型抗原的配型

必須做HLA交叉配型?。》椒ǎ貉a體依賴的細胞毒試驗（CDC)

雙向MLC

流式細胞術(shù)試驗時每一標本至少做3份，同時設陽性對照和陰性對照。（三）交叉配型

術(shù)后使用免疫抑制劑人工調(diào)節(jié)機體的免疫狀態(tài)是目前控制排斥反應發(fā)生最主要的方式。臨床上常用的免疫抑制劑有三類：二、免疫抑制措施1、化學性的免疫抑制劑

常見有：環(huán)孢素A、糖皮質(zhì)激素、硫唑嘌呤、環(huán)磷酰胺、他克莫司麥考酚嗎乙酯，西羅莫司等。2、生物免疫抑制劑

常見有：抗淋巴細胞球蛋白、抗細胞因子或細胞因子受體抗體、融合蛋白、反義寡核苷酸等。3、某些中草藥如雷公藤等。意義早期診斷排斥反應和監(jiān)測排斥危象的發(fā)生，以便及時采取措施。項目體液免疫水平的檢測（抗體、補體）細胞免疫水平的檢測

免疫分子的監(jiān)測第四節(jié)移植后的免疫監(jiān)測T細胞亞群及功能檢測

單克隆抗體免疫熒光法和流式細胞儀測定T細胞亞群，T細胞轉(zhuǎn)化試驗測定T細胞功能，4hT細胞轉(zhuǎn)化試驗檢測受者致敏T細胞。

NK細胞活性檢測

形態(tài)學法、熒光標記剩余法一、細胞免疫水平的監(jiān)測血清抗體的檢測包括抗供者HLA抗體、抗供者組織細胞抗體、抗血管內(nèi)皮細胞抗體、B細胞細胞毒抗體、冷凝集素等的檢測。方法：CDC、交叉配型等。血清補體的檢測

CH50試驗檢測活性，免疫擴散和免疫比濁試驗檢測含量。二、體液免疫水平的監(jiān)測細胞因子及其受體的檢測黏附分子的檢測其他分子的檢測

C反應蛋白（CRP）、β2-微球蛋白（β2m）三、免疫分子的監(jiān)測主要問題

移植排斥反應供體不足第五節(jié)器官移植面臨的主要問題和解決方案設想

方案1.誘導同種異型反應性T細胞耐受2.阻斷T細胞活化的協(xié)同刺激信號誘導T細胞無能3.調(diào)控Th細胞向Th2亞群轉(zhuǎn)化4.T細胞疫苗的研制一、誘導同種異體免疫耐受探索異種器官移植，是緩解目前器官移植供需矛盾的手段之一，目前異種器官移植尚不能成功地應用于臨床，主要