制備型高效液相課件

制備型高效液相制備型高效液相制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹了制備型高效液相色譜基礎(chǔ)理論及基本裝置,介紹了樣品的預(yù)處理和應(yīng)用實(shí)例,分析了目前制備型高效液相色譜技術(shù)存在的問題并對(duì)該技

術(shù)未來的發(fā)展進(jìn)行了展望。制備型高效液相色譜是一種快速,有效的分析分離工具。本文介紹2

高效液相色譜分析法

Highperformanceliquidchromatography一、液相色譜儀器

高效液相色譜分析法

Highperformanceli3制備型高效液相課件4

流程圖

流程圖5近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益受到人們的關(guān)注。人們?cè)谶\(yùn)用高效的篩選方法,從

植物、海洋生物及微生物中發(fā)現(xiàn)新的先導(dǎo)化合物的同時(shí)需要

一個(gè)快速、有效的分離方法以分離目標(biāo)化合物,而色譜技術(shù)

是迄今人類掌握的對(duì)復(fù)雜混合物分離效率最高的一種方法,

能夠分離物化性能差別很小的化合物[1]。分析型HPLC技

術(shù)一經(jīng)出現(xiàn)就引起廣大研究者,特別是分析化學(xué)工作者的高

度重視,使這項(xiàng)技術(shù)在分析應(yīng)用方面取得了巨大成功?，F(xiàn)在

隨著人們大規(guī)模分離的需要,制備型高效液相色譜技術(shù)也相

應(yīng)產(chǎn)生了,并受到了人們?cè)絹碓綇V泛的重視。在我國,該技

術(shù)已被列入863工程生物技術(shù)領(lǐng)域的攻關(guān)項(xiàng)目中[2]。由于

技術(shù)上的原因,長期以來制備型液相色譜技術(shù)發(fā)展緩慢,但

是隨著理論研究的深入,新穎的填料、新的填充方法以及在

儀器和流程上的進(jìn)展,近年來該技術(shù)獲得了很大的發(fā)展。近年來,從自然資源中尋找具有生物活性化合物的探索

工作日益61基礎(chǔ)理論人們對(duì)色譜基礎(chǔ)理論進(jìn)行不懈的研究,提出了眾多的理論。其中比較著名的有:1.平衡色譜理論。在1940年由Wilson[3]提出,該理論認(rèn)為在整個(gè)色譜過程中,組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配平衡能瞬間達(dá)成;2.塔板理論。在1941年由Martin和Synge[4]提出,該理論將色譜過程比擬為蒸餾過程,把色譜柱看成是由一系列平衡單元!理論塔板所組成。在每一個(gè)塔板高度內(nèi),組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配平衡能瞬間達(dá)成;3.縱向擴(kuò)散理論。由Amundson[5]等人通過大量實(shí)驗(yàn)提出,該理論認(rèn)為在色譜過程中,組分在流動(dòng)相的軸向擴(kuò)散是影響色譜區(qū)域譜帶擴(kuò)張的主要因素,而有限的傳質(zhì)速率對(duì)區(qū)域譜帶擴(kuò)張沒有影響;4.速率理論。該理論認(rèn)為組分在流動(dòng)相和固定相之間有限的傳質(zhì)速率是影響色譜區(qū)域譜帶擴(kuò)張的主要因素,而軸向擴(kuò)散的影響可以忽略;5.雙膜理論。Funk等人把流動(dòng)相和固定相看成是兩塊相互緊密接觸的平面薄膜,整個(gè)傳質(zhì)阻力為流動(dòng)相膜的傳質(zhì)阻力和固定相膜的傳質(zhì)阻力所構(gòu)成,組分在界面接觸處達(dá)到分配平衡。1基礎(chǔ)理論7簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體操作中兩者的指導(dǎo)思想?yún)s有著本質(zhì)的不同。在制備分離中,人們總是希望在盡可能短的時(shí)間里得到盡可能多的純組分。欲得到負(fù)載必須以分離效果為代價(jià),即在保持最低分辨率的前提下,使柱子超載以得到最大的物料通過量。而分析分離中在最短時(shí)間里得到最大的分離效率則是人們希望得到的[6]。制備分離選擇的是高柱效、高柱容量的色譜柱,而且使色譜柱在超載狀態(tài)下工作。所謂超載,通常將理論塔板數(shù)下降10%時(shí)柱容量[7]。較為理想的制備條件的選擇包括上柱量,容量因子,選擇性以及柱效[8]。簡單大男制備分離的色譜模型和分析分離的模型相似,但在具體82

基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(柱填料)和流

動(dòng)相(淋洗液)中分配系數(shù)的微小差異,當(dāng)二相作相對(duì)運(yùn)動(dòng)

時(shí),樣品中的各組分將形成不同的遷移速度的譜帶而實(shí)現(xiàn)分

離的新型高效分離技術(shù)。對(duì)于制備型HPLC而言,裝置不像對(duì)分析型HPLC那樣關(guān)鍵,使用不很高級(jí),價(jià)格較低的裝置

往往可以獲得令人滿意的分離效果。

制備型HPLC裝置主要由輸液泵、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜柱、檢

測器、餾分收集器、數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)等部分組成。2基本裝置

制備型HPLC是一種基于組分在固定相(92.1輸液泵在制備型HPLC不需要具有很高的輸送壓力,一般為19.6MPa。輸液泵采用的是恒流的機(jī)械往復(fù)泵或恒壓的氣動(dòng)放大泵較理想,因?yàn)樗鼈兙哂休^高的輸送速率和連續(xù)輸出溶劑的能力。然而當(dāng)采用裝入小顆粒固定相的粗柱進(jìn)行制備型HPLC時(shí),例外地需用能提供較大壓力的泵。在某些場合,所需壓力高達(dá)150bar,此時(shí)采用薄膜泵較合適。對(duì)于內(nèi)徑較小的制備柱可使用分析型的輸液泵,內(nèi)徑較大的制備柱,輸液泵所需的輸送能力可從分析型柱子所做的實(shí)驗(yàn)條件參數(shù)計(jì)算出來。2.1輸液泵102.2進(jìn)樣系統(tǒng)在制備型HPLC分離中,可以采用一個(gè)進(jìn)樣閥(如六通進(jìn)樣閥)將較大量的樣品方便的注入柱子而不影響流動(dòng)相流動(dòng)。通過更換樣品環(huán)可以方便的改變進(jìn)樣量,最大可達(dá)10mL。如果使用注射器,一般采用停留進(jìn)樣技術(shù),即樣品在常壓下注入,然后再從新起動(dòng)泵。若樣品量非常大,可以采用停留技術(shù),借助于一臺(tái)小體積泵將樣品定量地注入柱中。也可采用隔膜進(jìn)樣法,用注射器將樣品定量地注入柱中。2.2進(jìn)樣系統(tǒng)2.3色譜柱

相對(duì)于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提

供既穩(wěn)定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進(jìn)行填充,最常

用也是最易實(shí)現(xiàn)的效果較為理想的是動(dòng)態(tài)軸向壓縮柱

(DACTM)技術(shù)[9]。DAC技術(shù)為使用者提供了用任一種填料

自己裝填色譜柱、方便快速地調(diào)整柱長度的可能性。在制備

型HPLC中,色譜柱的內(nèi)徑可在100~500mm之間。一般增

大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產(chǎn)

量。增加色譜柱的長度則意味著可加入的樣品量和分辨率

的增大,但同時(shí)也增加了柱壓。研究表明對(duì)于難分離物系,

可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離

度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將

更為有利[10]。2.3色譜柱

相對(duì)于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱

2.4檢測器在現(xiàn)有的檢測器中,示差折光檢測器通常適用于制備分離,不過在某些系統(tǒng)中為了準(zhǔn)確地檢測樣品中所有峰,往往需要將示差與紫外分光光度檢測器配合使用。也可用薄層色譜對(duì)高濃度的流出液各流分進(jìn)行檢測,所以當(dāng)其他檢測方法不適用時(shí),可求助于薄層色譜檢測2.4檢測器2.5餾分收集器

在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當(dāng)?shù)氖占?。若收集一個(gè)或幾個(gè)已分離的組分,用手動(dòng)餾分收集器即可。然而當(dāng)大量樣品組分必須一次分離或?yàn)榱颂岣咭粋€(gè)或多個(gè)組分的收集量而要進(jìn)行多次重復(fù)性分離,使用自動(dòng)餾分收集器更為方便。如有可能,應(yīng)對(duì)溶劑回收再用,因而也應(yīng)盡量不使用混合溶劑[11]。在使用反相或聚合物吸附進(jìn)行分離時(shí),有時(shí)從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機(jī)溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液2.5餾分收集器142.6數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)國外的一些公司已經(jīng)相繼開發(fā)出商業(yè)化的具有某些人工智能特點(diǎn)的制備型HPLC整套設(shè)備。這些整套設(shè)備均是采用一臺(tái)計(jì)算機(jī)控制整個(gè)儀器的運(yùn)轉(zhuǎn),并進(jìn)行數(shù)據(jù)的收集、貯存和處理等工作,從而使制備型HPLC的分離速度以及自動(dòng)化程度等大為提高。2.6數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)國外的一些公司已經(jīng)相繼開發(fā)出商業(yè)化153

應(yīng)用

3.1制備型HPLC的樣品預(yù)處理在高壓液相色譜進(jìn)樣之前,需對(duì)樣品進(jìn)行過濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質(zhì),既方便又廉價(jià)。顆粒狀雜質(zhì)可能損壞高壓液相色譜儀的閥門,阻塞管道或柱子入口端的濾板。濾片可以是不銹鋼或塑料套的,但通常用一次性的聚丙烯外殼的濾片。這種濾片一般有凹陷的入口及一細(xì)凹的出口,可與注射器相連。過濾膜的材料可以是聚四氟乙烯、乙酸纖維、尼龍、紙或無機(jī)膜。在選用過濾膜時(shí)應(yīng)注意使其適合于所用的溶劑,這一點(diǎn)在使用含四氫呋喃的溶劑時(shí)尤其重要[12]。在色譜柱與進(jìn)樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質(zhì)和吸附性強(qiáng)的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當(dāng),對(duì)系統(tǒng)分離效果不會(huì)造成很大影響。硅膠預(yù)處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動(dòng)相所引起的麻煩,上訴物質(zhì)可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會(huì)在柱的上部形成空隙。預(yù)處理柱安裝在泵與進(jìn)樣器之間,這樣盡管流動(dòng)相被硅膠所飽和,但在進(jìn)樣途中不會(huì)有空隙或氣泡3應(yīng)用

3.1制備型HPLC的樣品預(yù)處理3.2制備規(guī)模按照分離一次進(jìn)樣量的多少,制備型HPLC有3種規(guī)

模,即半制備級(jí)HPLC、克級(jí)HPLC和工業(yè)級(jí)HPLC,如下表1所示。制備型HPLC以生產(chǎn)純物質(zhì)為目的,在經(jīng)濟(jì)合理的前提下,規(guī)模越大越好3.2制備規(guī)模按照分離一次進(jìn)樣量的多少,制備型HPLC醫(yī)學(xué)壓力演示文稿3.3柱超載方式分析型HPLC與制備型HPLC的根本區(qū)別在于分離目的不同[13]。在分析型中,需要的是反映樣品組成的信息,不需要收集達(dá)到特定純度的餾分,洗提液通常是作為廢液來考慮的。但在制備型HPLC中,為了節(jié)省投資和操作費(fèi)用,必須以最少的時(shí)間生產(chǎn)最大量的產(chǎn)品。由于目的不同,制備型HPLC與分析型HPLC所選用的操作方式有顯著不同。前者要求進(jìn)樣量越小越好,而后者為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的質(zhì)量超載,即維持較小的進(jìn)樣體積,但提高進(jìn)樣濃度;另一種是所謂的體積超載,即保持較小的進(jìn)樣濃度,但增加進(jìn)樣體積。在制備型HPLC中,一般認(rèn)為采用質(zhì)量超載的方式較好。王志祥[14]等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過程,發(fā)現(xiàn)在制備型HPLC分離過程中,分離度和柱效均隨質(zhì)量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質(zhì)量超載的方式操作,可以提高制備量。醫(yī)學(xué)壓力演示文稿3.3柱超載方式3.4流動(dòng)相進(jìn)行制備型液相色譜分離時(shí),所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動(dòng)相溶劑中含有微量的不揮發(fā)性雜質(zhì),當(dāng)大量溶劑經(jīng)蒸發(fā)后,其雜質(zhì)濃度就會(huì)增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應(yīng)在溶劑純度與所用數(shù)量之間進(jìn)行權(quán)衡。流動(dòng)相中的非揮發(fā)性添加劑會(huì)在產(chǎn)物回收時(shí)引起麻煩,這是可采用揮發(fā)性緩沖物來改進(jìn)分離效果,又易于將其除去。3.4流動(dòng)相3.5洗脫制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動(dòng)相的熱力學(xué)參數(shù)不變的等度洗脫法;一種是改變流動(dòng)相的一種或幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法3.5洗脫3.6被分離物質(zhì)的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當(dāng)?shù)氖占鳌Ｈ缬锌赡?應(yīng)對(duì)溶劑回收再用,因而也應(yīng)盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進(jìn)行分離時(shí),有時(shí)從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機(jī)溶劑,然后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來。如從環(huán)肽中脫鹽時(shí),先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等[15]在從植物薔薇中分離黃酮苷時(shí),采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。目前的發(fā)展趨勢(shì)是實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣與流分收集的自動(dòng)化,這樣可進(jìn)行連續(xù)的操作及反復(fù)的分離[16]。3.6被分離物質(zhì)的收集214在天然產(chǎn)物研究中的應(yīng)用實(shí)例肖偉濤,朱小蘭等人用制備高效液相色譜技術(shù)對(duì)25%茶葉提取物中茶氨酸進(jìn)行制備、分離純化。所得產(chǎn)品用外標(biāo)法定量分析,純度大于98%,制備收率大于60%[17]。彭密軍,周春山等人采用制備型HPLC分離純化,制備回收率為83.3%,相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.1%,綠原酸的純度達(dá)98.61%,同時(shí)可得到杜仲葉黃酮、桃葉珊瑚甙等副產(chǎn)品[18]。徐光國[19]運(yùn)用國產(chǎn)YZS-3型制備液相色譜儀分離制備了抗癌藥葫蘆素B標(biāo)準(zhǔn)品,茯苓三萜酸成分和金銀花中的主要成分綠原酸;陳若蕓[20]等用制備液相色譜技術(shù)制備了靈芝中的三萜類化合物;張仁斌[21]等用該技術(shù)對(duì)青蒿素異構(gòu)體進(jìn)行了分離制備。李軍等用制備型HPLC對(duì)曲克蘆丁原料進(jìn)行分離純化制得曲克蘆丁對(duì)照品,純度可達(dá)99%以上[22]。仲英等利用高效液相色譜Deltaprep3000制備系統(tǒng)純化藥典用葛根素對(duì)照品[23]。陳曉輝等利用制備型HPLC對(duì)野菊花的黃酮類化學(xué)成分進(jìn)行分離研究,分離純化了6個(gè)化學(xué)品,純度均為99%以上[24]。尚慶坤等使用制備型HPLC法分離虻蟲中的多肽樣品,制備收集了4種主要組分,經(jīng)檢測各組分達(dá)到很高純度[25]。彭密軍等使用制備HPLC從杜仲樣品中同時(shí)制備了AU、GPA、