基因診斷與基因治療培訓(xùn)教程課件

基因診斷與基因治療

第二十八章第二十八章第一節(jié)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)第二節(jié)遺傳病的基因診斷第三節(jié)傳染病的基因診斷第四節(jié)腫瘤的基因診斷第五節(jié)基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用第六節(jié)基因治療的概念及策略本章內(nèi)容提要第一節(jié)基因診斷學(xué)基礎(chǔ)本章內(nèi)容提要第一節(jié)

基因診斷學(xué)基礎(chǔ)

第一節(jié)

基因診斷學(xué)基礎(chǔ)

基因診斷之父—簡(jiǎn)悅威1976年加州大學(xué)華裔科學(xué)家用核酸分子雜交技術(shù)首次對(duì)一例α地中海貧血進(jìn)行診斷。基因診斷之父—簡(jiǎn)悅威1976年加州大學(xué)華裔一、基因診斷的概念、特點(diǎn)及臨床意義定義：利用分子生物學(xué)技術(shù)，通過(guò)檢測(cè)基因及基因表達(dá)產(chǎn)物的存在狀態(tài)，對(duì)人體疾病作出診斷的方法?；蛟\斷檢測(cè)的目標(biāo)分子是、，也可以是蛋白質(zhì)或者多肽。

一、基因診斷的概念、特點(diǎn)及臨床意義定義：診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)、或蛋白質(zhì)水平變化，如病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在體內(nèi)從無(wú)到有、癌基因表達(dá)水平從低到高；基因結(jié)構(gòu)變化，如點(diǎn)突變引起基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起基因異常激活或滅活。診斷依據(jù)(遺傳物質(zhì)改變)基因診斷的特點(diǎn)高特異性高靈敏性早期診斷性應(yīng)用廣泛性基因診斷的特點(diǎn)二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交（）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)()單鏈構(gòu)象多態(tài)性（）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（）序列測(cè)定（）生物芯片（）免疫印跡（）免疫組織化學(xué)診斷二、基因診斷中常用的分子生物學(xué)技術(shù)核酸分子雜交（）（一）核酸分子雜交

指兩條單鏈核酸在一定條件（溫度、鹽離子和有機(jī)溶劑濃度）下，按堿基互補(bǔ)的原則重新配對(duì)形成雙鏈的過(guò)程。（一）核酸分子雜交

指兩條核酸分子雜交流程待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜交的探針檢測(cè)雜交信號(hào)核酸探針制備探針標(biāo)記加入標(biāo)記探針核酸分子雜交流程待測(cè)核酸制備濾膜上核酸固化雜交去除未雜提取→限制性?xún)?nèi)切酶消化以產(chǎn)生特定長(zhǎng)度的片段→凝膠電泳分離→變性處理→轉(zhuǎn)印到膜上并使其牢固結(jié)合→將標(biāo)記的探針與膜上片段雜交，分析雜交信號(hào)。1.印跡雜交()提取→限制性?xún)?nèi)切酶消化以產(chǎn)生特經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，通過(guò)分子雜交檢測(cè)特定的分子的含量與大小。2.印跡雜交()經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移3.斑點(diǎn)雜交（）將或變性后直接點(diǎn)樣于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，用于基因組中特定基因及其表達(dá)產(chǎn)物的定性及定量的研究。3.斑點(diǎn)雜交（）將或變性后直接點(diǎn)4.反向斑點(diǎn)雜交

（）先將探針固定于硝酸纖維素膜或尼龍膜上，將樣品或標(biāo)記變性后進(jìn)行雜交。改變了傳統(tǒng)雜交方法中一次雜交只能檢測(cè)一種樣品的局限，大大提高了基因診斷的效率。4.反向斑點(diǎn)雜交

（）寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分子的穩(wěn)定性，可用人工合成的針對(duì)正常和突變探針進(jìn)行反向斑點(diǎn)雜交，檢測(cè)點(diǎn)突變，大大提高檢測(cè)結(jié)果的可靠性。等位基因特異性寡核苷酸(,）寡核苷酸中的堿基錯(cuò)配會(huì)大大影響雜交分5.原位分子雜交熒光原位雜交(,）掛鎖()5.原位分子雜交熒光原位雜交熒光原位雜交（）熒光原位雜交（）6.固相夾心雜交法

()待測(cè)靶基因序列上兩個(gè)相鄰但不重疊的片段（A、B片段），分別作為捕捉探針（不標(biāo)記的A片段）和檢測(cè)探針（標(biāo)記的B片段），同時(shí)與靶基因雜交。先將捕捉探針吸附于固相支持物上，與靶基因序列A部分雜交，再加入標(biāo)記的檢測(cè)探針，檢測(cè)探針與靶基因序列B部分雜交，檢測(cè)雜交信號(hào)。6.固相夾心雜交法

()待測(cè)固相夾心雜交法示意圖固相夾心雜交法示意圖（二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(,）模板引物

2+聚合酶變性延伸退火（二）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

(,）模板變性延伸在基因診斷中的應(yīng)用熒光定量多重在基因診斷中的應(yīng)用1.1.2.熒光定量熒光標(biāo)記引物2.熒光定量熒光標(biāo)記引物3.多重多重示意圖A：普通；B：多重3.多重多重示意圖A：普通；B：多重4.N：正?；?；H：雜合子基因；M：突變基因12NHM4.N：正?；颍籋：雜合子基因；M：突變基因12NHM（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（,）的突變?cè)斐善沃袎A基序列不同，變性為單鏈后在中性聚丙烯酰胺凝膠中的構(gòu)象不同（單鏈構(gòu)象多態(tài)性），利用遷移率的差別可使各種序列不同的單鏈分離開(kāi)來(lái)。（三）單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析

（,）分析原理示意分析原理示意正常人純合突變雜合突變+分析－正常人純合突變雜合突變+分析－（四）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

（,）由于變異產(chǎn)生新的酶切位點(diǎn)或原有的酶切位點(diǎn)消失，在用限制性核酸內(nèi)切酶消化時(shí)產(chǎn)生不同長(zhǎng)度或不同數(shù)量的片段?？山柚怂岱肿与s交或進(jìn)行檢測(cè)。（四）限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析

（,）設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一個(gè)或數(shù)個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶識(shí)別序列，在擴(kuò)增后用該限制酶切割產(chǎn)物，根據(jù)電泳后酶切片段長(zhǎng)度變化，即可作出診斷。設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)臄U(kuò)增引物，使擴(kuò)增片段包括某一ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的變化ABCDEFG－＋DEFBGCAEFBG－＋C+DAⅠ（五）序列測(cè)定（）（五）序列測(cè)定（）序列測(cè)定原理(雙脫氧末端終止法)序列測(cè)定原理(雙脫氧末端終止法)左側(cè)：正常；右側(cè)突變序列分析用于基因診斷研究左側(cè)：正常；右側(cè)突變序列分析用于基因診斷研究（六）生物芯片（）基因芯片（）蛋白質(zhì)芯片()

（六）生物芯片（）基因芯片（）基因芯片雜交流程示意圖基因芯片雜交流程示意圖基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題解決方案核酸分子雜交結(jié)果可靠但操作繁瑣選擇合適的探針靈敏度、特異性高設(shè)計(jì)合適的引物操作簡(jiǎn)便、檢出率不高選擇合適的片段結(jié)果可靠但限制較多選擇合適的限制酶測(cè)序可自動(dòng)化，但不適宜廣泛使用與配合使用生物芯片效率高，成本高，不適宜廣泛使用選擇合適的芯片基因診斷中常用的分子生物學(xué)方法比較方法優(yōu)點(diǎn)與問(wèn)題解決方案核酸三、基因診斷技術(shù)路線與方法

直接診斷：直接分析致病基因分子結(jié)構(gòu)及表達(dá)是否異常間接診斷：利用多態(tài)性遺傳標(biāo)志與致病基因進(jìn)行連鎖分析根據(jù)對(duì)致病基因或相關(guān)基因的了解程度決定基因診斷的技術(shù)途徑選擇。三、基因診斷技術(shù)路線與方法根據(jù)對(duì)（一）直接診斷途徑必要條件：◆被檢測(cè)基因變化與疾病發(fā)生有直接因果關(guān)系◆被檢基因正常分子結(jié)構(gòu)已被確定◆被檢基因致病的分子機(jī)制（突變位點(diǎn)或表達(dá)變化）已知（一）直接診斷途徑必要條件：5/——5/—3/3/—1.點(diǎn)突變的檢測(cè)

（1）有限制性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)改變5/——5/—3/3/—1.點(diǎn)突變的檢測(cè)

斑點(diǎn)雜交、反向斑點(diǎn)雜交、、、產(chǎn)物直接測(cè)序5/——5/—3/3/—（2）無(wú)限制性酶切位點(diǎn)改變斑點(diǎn)雜交、反向斑點(diǎn)雜交5/——5/—3/3/—（2）無(wú)限制性在序列上有一段較長(zhǎng)序列的重新排布。包括數(shù)十個(gè)堿基到數(shù)千個(gè)堿基的丟失、插入、替換、重復(fù)和倒位等，以及染色體突變或畸變，包括染色體的易位、缺失或染色三體（如唐氏綜合征）等。2.基因重排的檢測(cè)核酸分子探針雜交與在序列上有一段較長(zhǎng)序列的重新排布。包括數(shù)十個(gè)α2α1α21014probe-珠蛋白生成障礙性貧血的直接基因診斷-珠蛋白基因不同程度的缺失可引起不同類(lèi)型的-珠蛋白生成障礙性貧血α2α1α21014probe-珠蛋白生成障礙性根據(jù)引物3′端的互補(bǔ)與否，設(shè)計(jì)一對(duì)與正?；蛲蛔兡０迮鋵?duì)的特異引物

等位基因特異（）根據(jù)引物3′端的互補(bǔ)與否，設(shè)計(jì)一對(duì)與正?；蛲?.基因表達(dá)異常的檢測(cè)

的相對(duì)定量分析的絕對(duì)定量分析長(zhǎng)度分析3.基因表達(dá)異常的檢測(cè)（二）間接診斷途徑1.采用原因致病基因未知或基因結(jié)構(gòu)不確定致病突變機(jī)制不清致病位點(diǎn)不便檢測(cè)（二）間接診斷途徑1.采用原因

多態(tài)性：指群體中的分子存在至少兩種不同的類(lèi)型，即個(gè)體間同一染色體的相同位置上核苷酸序列存在一定的差異或變異。多在進(jìn)化中形成，本身并不致病，只是與某些遺傳性致病基因有一定連鎖關(guān)系。2.遺傳標(biāo)記2.遺傳標(biāo)記間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記三代遺傳標(biāo)記：（基于核酸分子雜交技術(shù)）();

()()間接診斷：檢測(cè)與致病基因連鎖的遺傳標(biāo)記三代遺傳標(biāo)記：7.613患者正常的間接基因診斷

——標(biāo)記的連鎖分析Ⅰ7.613印跡雜交NHPN：正常；H：雜合子；P：患者（純合子）；黃色區(qū)域?yàn)樘结?.613患者正常的間接基因診斷

——標(biāo)記第二節(jié)

遺傳病的基因診斷

第二節(jié)

遺傳病的基因診斷

一、血紅蛋白?。ǎㄒ唬╃牋罴?xì)胞貧血?。ǘ│?珠蛋白生成障礙性貧血癥

二、血友?。ǎ┘仔脱巡』蛟\斷三、脆性X綜合征一、血紅蛋白?。ǎ?/p>

（一）鐮狀細(xì)胞貧血病一、血紅蛋白病1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷——雜交法

2的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析

3的分析

（一）鐮狀細(xì)胞貧血病一、血紅蛋白病1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基正常的（N）的探針：5′3′突變的（M）的探針：5′3′1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷

雜交法正常的（N）的探針：1.鐮狀紅細(xì)胞貧血患者基因診斷

雜交法斑點(diǎn)雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者雜交法檢測(cè)正常突變突變

純合子雜合子純合子斑點(diǎn)雜交結(jié)果N：正常；M突變鐮狀紅細(xì)胞貧血患者雜交法檢測(cè)正5′3′正?；?.15(G)×5′3′突變基因1.35(G)鐮狀紅細(xì)胞貧病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析Ⅱ酶切位點(diǎn)（）2.的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析目錄5′3′正?；?.15(G)×5′3′突變基因1.350.21.151.35正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血病的限制性?xún)?nèi)切酶譜分析目錄0.21.151.35正常人突變攜帶者患者鐮狀紅細(xì)胞貧血病的3.的分析正常人的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ⅱ消化可生成54和56兩個(gè)片段，而鐮狀細(xì)胞貧血癥患者的片段不被酶切，仍為110，雜合子可見(jiàn)三條帶正常人雜合體患者3.的分析正常人的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)Ⅱ消化可生成54和51.分析-珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子17突變的檢測(cè)M：322I;1:未酶解片段；2：；3：；4：注：由于54、114、72片段及分子量標(biāo)準(zhǔn)中低于200的片段太小，在0.8％的瓊脂糖凝膠中不易被觀察到（二）-珠蛋白生成障礙性貧血癥1.分析-珠蛋白生成障礙性貧血癥基因密碼子1-珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點(diǎn)雜交分析2.反向斑點(diǎn)雜交-珠蛋白生成障礙性貧血癥的反向斑點(diǎn)雜交分析2.反向斑點(diǎn)雜二、血友?。ǎ┘仔脱巡∈怯捎谘獫{凝血因子（）缺陷造成。甲型血友病的基因突變類(lèi)型已有300余種，其中點(diǎn)突變占174種；另有部分患者是由于缺失或插入突變或內(nèi)含子22的基因倒位所致。二、血友?。ǎ┘仔脱巡∈怯捎谘獫{凝血因子（）缺陷造成。1.基因倒位的印跡分析將基因組用I，I或I等內(nèi)切酶（酶切位點(diǎn)位于交換點(diǎn)兩側(cè)）消化，用特異探針進(jìn)行雜交分析，正常人表現(xiàn)為21.5、14和16三種類(lèi)型。I型倒位患者表現(xiàn)為20、17.5和14三種類(lèi)型；Ⅱ型倒位患者表現(xiàn)為20、16和15.5三種帶型。在一些重型甲型血友病家系中還有其他異常帶型出現(xiàn)。1.基因倒位的印跡分析將基因組2.基因突變的檢測(cè)（1）依賴(lài)于基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記的連鎖分析（2）連鎖分析（3）分析（4）短串聯(lián)重復(fù)序列（）的連鎖分析2.基因突變的檢測(cè)（1）依賴(lài)于基因內(nèi)或旁側(cè)的多態(tài)性標(biāo)記的連三、脆性X綜合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻譯區(qū)遺傳不穩(wěn)定的()n三核苷酸重復(fù)序列的異常擴(kuò)增以及相鄰島的異常甲基化。正常人中約為8～50拷貝。男性和女性攜帶者增多到52～200拷貝，相鄰的島未被甲基化，稱(chēng)為前突變（）。男性患者和脆性部位高表達(dá)的女性中，達(dá)到200～1000拷貝，相鄰的島也被甲基化，稱(chēng)為全突變（）。全突變可關(guān)閉相鄰1基因的表達(dá)，1在幾乎所有患者不表達(dá)或只有低表達(dá)，從而出現(xiàn)臨床癥狀。三、脆性X綜合征脆性X智力低下基因1（1）5ˊ非翻譯區(qū)遺脆性X綜合征常用基因診斷方法1．2．連鎖分析3．印跡雜交法4．?dāng)U增脆性X綜合征常用基因診斷方法第三節(jié)

傳染病的基因診斷

目錄第三節(jié)

傳染病的基因診斷

目錄一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）系病毒，利用技術(shù)可從糞便中檢測(cè)出甲型肝炎病毒的基因組。乙型肝炎病毒（）設(shè)計(jì)保守區(qū)序列引物，擴(kuò)增各型片段；設(shè)計(jì)位于可變區(qū)的引物擴(kuò)增某一亞型，以便分型。丙型肝炎病毒（）為正鏈病毒，先反轉(zhuǎn)錄成，再進(jìn)行巢式檢測(cè)。目錄一、病毒性疾病甲型肝炎病毒（）目錄二、細(xì)菌引起的疾病結(jié)核分枝桿菌先設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用技術(shù)擴(kuò)增出一383序列，再用探針雜交，靈敏度可達(dá)到100個(gè)細(xì)菌水平。幽門(mén)螺桿菌（）主要采用技術(shù)：①檢測(cè)染色體特異片段；②檢測(cè)尿素酶A基因；③用鑒別菌株。二、細(xì)菌引起的疾病結(jié)核分枝桿菌三、寄生蟲(chóng)及衣原體感染瘧原蟲(chóng)卡氏肺孢子蟲(chóng)衣原體感染

診斷方法：核酸雜交和技術(shù)

三、寄生蟲(chóng)及衣原體感染瘧原蟲(chóng)第四節(jié)

腫瘤的基因診斷

第四節(jié)

腫瘤的基因診斷

一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷乳腺癌結(jié)腸癌一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)1．原癌基因的檢測(cè)基因家族由、和組成。最常見(jiàn)的突變是第12、13、59或第61位密碼子的點(diǎn)突變。胰腺癌、結(jié)腸癌、肺癌以突變?yōu)橹?，如?2位密碼子突變，由編碼甘氨酸的突變?yōu)椤⒒?，少?shù)突變?yōu)椤＜毙粤馨图?xì)胞白血病，慢性淋巴細(xì)胞白血病等以突變?yōu)橹鳎幻谀蛳到y(tǒng)腫瘤則以突變?yōu)橹?。一、原癌基因與抑癌基因的檢測(cè)1．原癌基因的檢測(cè)及分析：擴(kuò)增基因第12位密碼子點(diǎn)突變部位，再用技術(shù)進(jìn)行分析，或者直接測(cè)序確定患者原癌基因的點(diǎn)突變。

核苷酸雜交技術(shù)（如）：檢測(cè)基因第12位密碼子點(diǎn)突變。2.原癌基因突變常用的檢測(cè)方法及分析：擴(kuò)增基因第12位密碼子3．抑癌基因p53的檢測(cè)p53基因以密碼子第175位、第248位、第249位、第273位及第282位點(diǎn)突變率最高。在結(jié)直腸癌、乳腺癌、小細(xì)胞肺癌，都可見(jiàn)異常的p53基因蛋白。p53的基因診斷方法有（1）分析技術(shù)（2）序列分析（3）分析3．抑癌基因p53的檢測(cè)p53基因以密碼子第175位、第2（一）乳腺癌1．乳腺癌常見(jiàn)基因變異5%～10%乳腺癌患者有家族遺傳性。乳腺癌高危家族中常有抑癌基因的基因（）的突變。1突變易致乳腺癌。突變分布于整個(gè)編碼序列，沒(méi)有明顯的突變簇或突變熱點(diǎn)。70%的缺失或插入導(dǎo)致編碼序列的框移和翻譯提前終止。1在N端的一半部位截短，與乳腺癌和卵巢癌的高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)；而在C端截短則主要與乳腺癌高危有關(guān)。2基因在30%～40%的散發(fā)性乳腺癌有雜合性缺失（）。突變提高乳腺癌易感性。二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷（一）乳腺癌1．乳腺癌常見(jiàn)基因變異二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷（1）法檢測(cè)1基因突變（2）熒光原位雜交（）檢測(cè)2基因擴(kuò)增2．乳腺癌基因診斷方法（1）法檢測(cè)1基因突變2．乳腺癌基因診斷方法（二）結(jié)腸癌1.結(jié)腸癌常見(jiàn)基因變異在癌發(fā)展過(guò)程的不同階段發(fā)生不同的基因突變。（）是結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中第一個(gè)突變基因。原癌基因突變也是結(jié)腸癌形成的早期事件。（）基因失活是結(jié)腸癌發(fā)展的晚期事件。抑癌基因4和2也可能會(huì)因18q等位基因丟失而失活。p53基因的突變是結(jié)腸癌發(fā)展過(guò)程的晚期現(xiàn)象。修復(fù)基因也與結(jié)腸癌有關(guān)。如2、1、1或2基因的突變所致的錯(cuò)配修復(fù)缺陷與遺傳性非息肉性結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)。二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷（二）結(jié)腸癌1.結(jié)腸癌常見(jiàn)基因變異二、常見(jiàn)腫瘤的基因診斷（1）法：對(duì)腺瘤樣息肉病人基因技術(shù)進(jìn)行分析。（2）異源雙鏈法：檢測(cè)基因變異。（3）蛋白質(zhì)免疫印跡法：檢測(cè)因基因突變而縮短了的蛋白。2．結(jié)腸癌基因診斷方法（1）法：對(duì)腺瘤樣息肉病人基因技術(shù)進(jìn)行分析。2．結(jié)腸癌基因第五節(jié)

基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

目錄第五節(jié)

基因診斷在法醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用

目重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱(chēng)為串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)次數(shù)在人群中存在變異，形成多態(tài)性。串聯(lián)重復(fù)序列散在分布于染色體上。重復(fù)單位6～25長(zhǎng)，稱(chēng)為小衛(wèi)星。

重復(fù)單位2～6長(zhǎng)，如（）n,()n等，稱(chēng)為微衛(wèi)星。一、指紋與多態(tài)性遺傳標(biāo)記重復(fù)序列以各自核心序列（重復(fù)單元）首尾相連多次重復(fù)，稱(chēng)為串聯(lián)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列()

人類(lèi)染色體上小衛(wèi)星的高度可變區(qū)（）是由頭尾相連的串聯(lián)重復(fù)序列（，）組成，的核心序列同源性很高，等位的長(zhǎng)度由于的重復(fù)次數(shù)不同而有很大的差別，具高度多態(tài)性。可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列()長(zhǎng)度多態(tài)除可用印跡雜交法檢測(cè)外，還可以通過(guò)擴(kuò)增后電泳來(lái)檢出。擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)（,）長(zhǎng)度多態(tài)除可用印跡雜交法檢測(cè)外，還可以通1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家等人用的核心序列為探針進(jìn)行分析時(shí)，檢測(cè)到許多，并產(chǎn)生相應(yīng)的圖譜，所得圖譜具有高度的個(gè)體特異性，達(dá)到了如同人類(lèi)指紋那樣的高度專(zhuān)一性，所以稱(chēng)其為指紋圖譜（）。

,目錄1985年，英國(guó)遺傳學(xué)家等人用的核心序列為探針進(jìn)行人類(lèi)指紋圖人類(lèi)指紋圖二、指紋與法醫(yī)學(xué)診斷個(gè)體識(shí)別和親子鑒定：指紋技術(shù)是從基因水平檢測(cè)的高度多態(tài)性，個(gè)體識(shí)別率高。以往在刑事案件的法醫(yī)學(xué)鑒定中應(yīng)用的是血型、血清蛋白型、紅細(xì)胞酶型和分型，個(gè)體分辨能力不夠，只能排除，不能做到統(tǒng)一認(rèn)證。二、指紋與法醫(yī)學(xué)診斷個(gè)體識(shí)別和親子鑒定：指紋技術(shù)是從基因水法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù)（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列/小衛(wèi)星）的核酸分子雜交分析（短串聯(lián)重復(fù)序列/微衛(wèi)星）的分析的基因芯片檢測(cè)法醫(yī)案檢中的基因診斷技術(shù)（可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列/小衛(wèi)星）的核1．單位點(diǎn)探針檢測(cè)及值的計(jì)算父權(quán)指數(shù)（，）值、父權(quán)相對(duì)指數(shù)或親子關(guān)系概率值計(jì)算方法基本一致。值表示爭(zhēng)議父作為親父比隨機(jī)男人作為親父的可能性大多少倍，值大于1表示傾向肯定父子關(guān)系，數(shù)值越大，可能性越大；等于0時(shí)表示排除父子關(guān)系。1．單位點(diǎn)探針檢測(cè)及值的計(jì)算父權(quán)指2．指紋圖與親權(quán)鑒定多位點(diǎn)系統(tǒng)和指紋圖的電泳分離后片段數(shù)目較多，各等位基因頻率分布的計(jì)算復(fù)雜，進(jìn)行親權(quán)鑒定和個(gè)體識(shí)別時(shí)匹配概率的計(jì)算影響因素較多，目前尚無(wú)一個(gè)公認(rèn)的最合理的計(jì)算方法。目前解決親權(quán)糾紛最簡(jiǎn)單的辦法是先在孩子指紋圖中找出非母片段并計(jì)數(shù)為P，然后分析爭(zhēng)議父指紋圖，看P條非母帶在爭(zhēng)議父中出現(xiàn)多少條。2．指紋圖與親權(quán)鑒定多位點(diǎn)系統(tǒng)和親權(quán)鑒定與指紋圖由此圖可推斷出：A和C是親生女兒；B為妻子和其前夫所生；D為養(yǎng)女。親權(quán)鑒定與指紋圖第六節(jié)

基因治療的概念及策略

目錄第六節(jié)

基因治療的概念及策略

目錄基因治療：指將目的基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)）導(dǎo)入靶細(xì)胞內(nèi)，目的基因表達(dá)產(chǎn)物對(duì)疾病起治療作用。目錄基因治療：指將目的基因通過(guò)基因轉(zhuǎn)移技術(shù)（病毒載體介導(dǎo)或者非病狹義基因治療：指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后與宿主細(xì)胞內(nèi)的基因發(fā)生整合、成為宿主基因組的一部分，目的基因表達(dá)產(chǎn)物起治療疾病的作用。廣義基因治療：①外源正?；?qū)氩∽兗?xì)胞，產(chǎn)生正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物以補(bǔ)充缺失的或失去正常功能的蛋白質(zhì)；②采用適當(dāng)?shù)募夹g(shù)抑制細(xì)胞內(nèi)過(guò)度表達(dá)的基因；③將特定的基因?qū)敕遣∽兗?xì)胞，在體內(nèi)表達(dá)特定產(chǎn)物；④向功能異常的細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）中導(dǎo)入該細(xì)胞中本來(lái)不存在的基因（如自殺基因），利用這些基因的表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。目錄狹義基因治療：指目的基因?qū)氚屑?xì)胞后本節(jié)內(nèi)容提要

一、基因治療的策略

二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基因干預(yù)

四、基因治療的應(yīng)用研究

五、基因治療的前景與問(wèn)題目錄本節(jié)內(nèi)容提要

一、基因治療的策略

二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)

三、基基因治療分類(lèi)體細(xì)胞()基因治療生殖細(xì)胞()基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變只限于某個(gè)體的當(dāng)代對(duì)缺陷的生殖細(xì)胞進(jìn)行矯正當(dāng)代及子代基因治療分類(lèi)體細(xì)胞()基因治療只限于某一體細(xì)胞的基因的改變一、基因治療的策略一、基因治療的策略（一）基因置換（）

定義：指將特定的目的基因?qū)胩囟?xì)胞，通過(guò)定位重組，導(dǎo)入的正?；?，以置換基因組內(nèi)原有的缺陷基因。

目的：將缺陷基因的異常序列進(jìn)行橋正。對(duì)缺陷基因的缺陷部位進(jìn)行精確的原位修復(fù)，不涉及基因組的任何改變。（一）基因置換（）定義：指將特定的定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組具有相同的序列。帶有目的基因的載體就能找到同源重組的位點(diǎn)，進(jìn)行部分基因序列的交換?；蛲粗亟M技術(shù)又稱(chēng)為基因打靶(）細(xì)胞內(nèi)基因同源重組的發(fā)生率很低?；蛲粗亟M技術(shù)定向整合的條件:轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的載體與基因組具有相同的序列。帶有目（二）基因添加（）定義:通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)其本身不表達(dá)的基因。類(lèi)型:在有缺陷基因的細(xì)胞中導(dǎo)入相應(yīng)的正?；颍?xì)胞內(nèi)的缺陷基因并未除去，通過(guò)導(dǎo)入正?；虻谋磉_(dá)產(chǎn)物，補(bǔ)償缺陷基因的功能；向靶細(xì)胞中導(dǎo)入靶細(xì)胞本來(lái)不表達(dá)的基因，利用其表達(dá)產(chǎn)物達(dá)到治療疾病的目的。（二）基因添加（）定義:通過(guò)導(dǎo)入外源基因使靶細(xì)胞表達(dá)（三）基因干預(yù)（）定義：采用特定的方式抑制某個(gè)基因的表達(dá)，或者通過(guò)破壞某個(gè)基因的結(jié)構(gòu)而使之不能表達(dá)，以達(dá)到治療疾病的目的。（三）基因干預(yù)（）定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒性的藥物前體轉(zhuǎn)化為細(xì)胞毒性代謝物，誘導(dǎo)靶細(xì)胞產(chǎn)生“自殺”效應(yīng)，從而達(dá)到清除腫瘤細(xì)胞的目的。應(yīng)用：是惡性腫瘤基因治療的主要方法之一。（四）自殺基因治療()定義：將“自殺”基因?qū)胨拗骷?xì)胞中，這種基因編碼的酶能使無(wú)毒自殺基因的作用機(jī)制自殺基因的作用機(jī)制?單純皰疹病毒（,）Ⅰ型胸苷激酶（,）基因編碼胸苷激酶，特異性地將無(wú)毒的核苷類(lèi)似物丙氧鳥(niǎo)苷（,）轉(zhuǎn)變成毒性三磷酸核苷，后者能抑制聚合酶活性，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。1.自殺基因系統(tǒng)?單純皰疹病毒（,）Ⅰ型胸苷激酶（,）基因編碼胸定義:“自殺基因”導(dǎo)入后，不僅使轉(zhuǎn)導(dǎo)了“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞在用藥后被殺死，而且與其相鄰的未轉(zhuǎn)導(dǎo)“自殺基因”的腫瘤細(xì)胞也被殺死。2.旁觀者效應(yīng)（）定義:2.旁觀者效應(yīng)（）（五）基因免疫治療通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)的細(xì)胞因子或基因?qū)肽[瘤組織，以增強(qiáng)腫瘤微環(huán)境中的抗癌免疫反應(yīng)。（五）基因免疫治療通過(guò)將抗癌免疫增強(qiáng)二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)二、基因轉(zhuǎn)移技術(shù)基因治療的兩種途徑載體目的基因

靶細(xì)胞目錄基因治療的兩種途徑載體目的基因靶細(xì)胞目錄基因轉(zhuǎn)移()技術(shù)1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移2.非病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移基因轉(zhuǎn)移()技術(shù)1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移效率較高，因此它也是使用最多的基因治療載體。據(jù)統(tǒng)計(jì)，有72%的臨床實(shí)驗(yàn)計(jì)劃和71%的病例使用了病毒載體，其中用得最多的是反轉(zhuǎn)錄病毒載體。1.病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)病毒載體反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒反轉(zhuǎn)錄病毒的結(jié)構(gòu)及生活周期（1）反轉(zhuǎn)錄病毒兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列。

反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由U3、R和U5三部分組成。病毒有三個(gè)結(jié)構(gòu)基因5ˊ端下游有一段病毒包裝所必需的序列（ψ）及剪接供體位點(diǎn)()和剪接受體位點(diǎn)()。

含有負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)()和正鏈轉(zhuǎn)錄的引物結(jié)合位點(diǎn)。在U3內(nèi)有增強(qiáng)子和啟動(dòng)子；U3和U5兩端分別有病毒整合序列()；在R內(nèi)還有(A)加尾信號(hào)。

基因，編碼核心蛋白和屬特異性抗原；基因，編碼反轉(zhuǎn)錄酶；基因，編碼病毒外殼或包膜糖蛋白(包括外膜糖蛋白和穿膜蛋白)。

兩端各有一長(zhǎng)末端重復(fù)序列。反轉(zhuǎn)錄病毒前病毒的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部分組成反轉(zhuǎn)錄病毒載體：其基因組為缺陷型，保留了病毒的包裝信號(hào)ψ，而缺失病毒的包裝蛋白基因；它可以克隆并表達(dá)外源治療基因，但不能自我包裝成有增殖能力的病毒顆粒。輔助細(xì)胞株(如317)：由另一種缺陷型反轉(zhuǎn)錄病毒（即帶有全套病毒包裝蛋白基因，但缺失包裝信號(hào)ψ的反轉(zhuǎn)錄病毒）感染構(gòu)建而成。能合成包裝蛋白，用于反轉(zhuǎn)錄病毒載體包裝，但本身卻不能包裝成輔助病毒顆粒。反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

——由兩部

反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)

①反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上編碼的糖蛋白，能夠被許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞膜上的特異性受體識(shí)別，從而使反轉(zhuǎn)錄病毒攜帶的遺傳物質(zhì)高效地進(jìn)入靶細(xì)胞。

②反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因、和的缺失不影響其他部分的活性。

③前病毒通過(guò)高效整合至靶細(xì)胞基因組中，有利于外源基因在靶細(xì)胞中的永久表達(dá)。

④包裝好的假病毒顆粒（攜帶目的基因的重組反轉(zhuǎn)錄病毒載體）以出芽的方式分泌至輔助細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中，易于分離制備。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的特點(diǎn)①反轉(zhuǎn)錄病毒包膜上編碼的糖蛋反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)

隨機(jī)整合，有插入突變、激活癌基因的潛在危險(xiǎn)；反轉(zhuǎn)錄病毒載體的容量較小，只能容納7以下的外源基因。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的主要缺點(diǎn)（2）腺病毒()載體

腺病毒是一種大分子(36)雙鏈無(wú)包膜病毒。它通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，然后腺病毒基因組轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，保持在染色體外，不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組中。腺病毒是人類(lèi)呼吸道感染的病原體，但目前尚未發(fā)現(xiàn)與腫瘤發(fā)生有關(guān)聯(lián)。宿主細(xì)胞范圍廣，可感染分裂和非分裂終末分化細(xì)胞，如神經(jīng)元等。（2）腺病毒()載體目錄目錄腺病毒的優(yōu)點(diǎn)基因?qū)胄矢撸瑢?duì)人類(lèi)安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與細(xì)胞分裂無(wú)關(guān)；重組腺病毒可通過(guò)口服經(jīng)腸道吸收、或噴霧吸入或氣管內(nèi)滴注；腺病毒載體容量較大，可插入7.5外源基因。目錄腺病毒的優(yōu)點(diǎn)基因?qū)胄矢?，?duì)人類(lèi)安全；宿主范圍廣；基因轉(zhuǎn)導(dǎo)腺病毒載體缺點(diǎn)宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。有兩個(gè)環(huán)節(jié)可能產(chǎn)生復(fù)制型腺病毒。靶向性差。不能整合到靶細(xì)胞的基因組中。分裂增殖快的細(xì)胞，導(dǎo)入的重組病毒載體，隨分裂而丟失的機(jī)會(huì)增多，表達(dá)時(shí)間相對(duì)較短。腺病毒載體缺點(diǎn)宿主的免疫反應(yīng)導(dǎo)致腺病毒載體表達(dá)短暫。有兩（3）腺病毒相關(guān)病毒載體

一類(lèi)單鏈線狀缺陷型病毒。其基因組小于5，無(wú)包膜，外形為裸露的20面體顆粒。不能獨(dú)立復(fù)制，只有在輔助病毒（如腺病毒、單純皰疹病毒等）存在時(shí)，才能進(jìn)行復(fù)制和溶細(xì)胞性感染，否則只能建立溶源性潛伏感染。AAVVirusParticles（3）腺病毒相關(guān)病毒載體AAVVirusParticle

：病毒復(fù)制基因,：編碼衣殼蛋白的基因：反向末端重復(fù)序列：病毒復(fù)制基因,：編碼衣殼蛋白的基因：反向末端重的特點(diǎn)以潛伏感染為主；病毒基因組與細(xì)胞共存；只要宿主細(xì)胞正常，基因表達(dá)被抑制而維持潛伏狀態(tài)；若細(xì)胞受刺激，表達(dá)應(yīng)激基因，基因表達(dá)從而使病毒復(fù)制；產(chǎn)生子代病毒并釋放，又感染新的細(xì)胞，建立新的潛伏狀態(tài)。的特點(diǎn)以潛伏感染為主；載體是目前正在研究的一類(lèi)新型安全載體，它對(duì)人類(lèi)無(wú)致病性。可以高效定點(diǎn)整合至人19號(hào)染色體的特定區(qū)域19q13.4中，并能較穩(wěn)定地存在。這種靶向定點(diǎn)整合可以避免隨機(jī)整合可能帶來(lái)的抑癌基因失活和原癌基因激活的潛在危險(xiǎn)性，而且外源基因可以持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)，并可受到周?chē)虻恼{(diào)控，兼具反轉(zhuǎn)錄病毒載體和腺病毒載體兩者的優(yōu)點(diǎn)。目錄載體是目前正在研究的一類(lèi)新型安全載體載體的缺陷載體容量小，目前最多只能容納5外源片段；感染效率比反轉(zhuǎn)錄病毒載體低,在4080%的成人中存在過(guò)感染;可能會(huì)引起免疫排斥。載體的缺陷載體容量小，目前最多只能容常用基因治療載體

整合致病性感染細(xì)胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒載體隨機(jī)整合，效率高可能致病分裂細(xì)胞<7kb腺病毒載體不整合，可能丟失不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞

腺相關(guān)病毒載體定點(diǎn)整合(19號(hào)染色體特定區(qū)域)不致病分裂細(xì)胞、非分裂細(xì)胞<5kb<7.5常用基因治療載體

整合致病性感染細(xì)胞克隆容量反轉(zhuǎn)錄病毒2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)

（1）脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使用方便、成本低廉。基本原理:利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體單體與混合后，可以自動(dòng)形成包埋外源的脂質(zhì)體，然后與細(xì)胞一起孵育，即可通過(guò)細(xì)胞內(nèi)吞作用將外源（即目的基因）轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行表達(dá)。2.非病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖目錄脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移示意圖目錄（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)

將與細(xì)胞或組織親和性的配體偶聯(lián)，可使具有靶向性。這種偶聯(lián)通常通過(guò)多聚陽(yáng)離子（如多聚賴(lài)氨酸）來(lái)實(shí)現(xiàn)。多聚陽(yáng)離子與配體共價(jià)連接后，又通過(guò)電荷相互作用與帶負(fù)電荷的結(jié)合，將包圍，只留下配體暴露于表面。這樣形成的復(fù)合物可被帶有特異性受體的靶細(xì)胞吞飲，從而將外源導(dǎo)入靶細(xì)胞。（2）受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)將與細(xì)胞或組織受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖目錄受體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移技術(shù)示意圖目錄（3）基因直接注射技術(shù)不需要進(jìn)行基因工程的繁瑣操作，直接將裸露注入動(dòng)物肌肉或某些器官組織內(nèi)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：接受注射外源的小鼠能夠按其基因編碼合成相應(yīng)的蛋白質(zhì)，并能維持?jǐn)?shù)月之久。

將促進(jìn)心臟血管生長(zhǎng)的基因直接注入實(shí)驗(yàn)鼠的心臟，可使其心臟壁內(nèi)毛細(xì)血管增加30%～40%；將胰島素基因直接注入鼠骨骼肌細(xì)胞，能分泌糖尿病所缺少的胰島素；肌內(nèi)注射凝血因子Ⅸ基因，可產(chǎn)生血友病所需的凝血因子Ⅸ。（3）基因直接注射技術(shù)基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒重組體的技術(shù)較容易；排除病毒載體可能潛在的致癌性或其他副作用；導(dǎo)入的基因不需整合即可表達(dá)，避免了反轉(zhuǎn)錄病毒載體導(dǎo)入整合后，一旦發(fā)生副作用不易中止或逆轉(zhuǎn)的缺點(diǎn)；基因直接注射法可反復(fù)使用，而病毒載體則可能誘導(dǎo)體內(nèi)免疫應(yīng)答，致使反復(fù)治療效果下降。基因直接注射法的優(yōu)點(diǎn)制備具有調(diào)控部件的質(zhì)粒三、基因干預(yù)（）

基因診斷與基因治療培訓(xùn)教程課件（一）反義（）

1.反義與基因表達(dá)調(diào)控利用反義對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行基因表達(dá)調(diào)控，通常采用的方法有兩種：（1）體外合成反義，直接作用于培養(yǎng)細(xì)胞，細(xì)胞吸收后，發(fā)揮作用。（2）構(gòu)建一些能轉(zhuǎn)錄反義的重組質(zhì)粒，將這些質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，轉(zhuǎn)錄出反義而發(fā)揮作用。（一）反義（）反義的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題?反義進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題?專(zhuān)一性轉(zhuǎn)移問(wèn)題反義的關(guān)鍵技術(shù)問(wèn)題?反義進(jìn)入靶細(xì)胞前的降解問(wèn)題?2.受體介導(dǎo)反義技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移十分專(zhuān)一，而且效率高；②被轉(zhuǎn)移的是被保護(hù)的，與周?chē)h(huán)境之間存在多聚賴(lài)氨酸的保護(hù)層,可以抵抗環(huán)境中的核酸酶的降解作用。借助前述的受體介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法，可以實(shí)現(xiàn)受體介導(dǎo)的反義轉(zhuǎn)移。2.受體介導(dǎo)反義技轉(zhuǎn)移術(shù)①受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移十分專(zhuān)一，而且效3.反義的優(yōu)點(diǎn)受體介導(dǎo)的反義基因治療有其自身的優(yōu)點(diǎn)，而在一定程度上補(bǔ)充了轉(zhuǎn)基因治療的不足。

（l）安全性高（2）反義設(shè)計(jì)和制備方便

（3）具有劑量調(diào)節(jié)效應(yīng)

（4）能直接作用于一些病毒3.反義的優(yōu)點(diǎn)受體介導(dǎo)的反義基（二）核酶()

天然核酶多為單一的分子，具有自我剪切作用。但核酶也可以由兩個(gè)分子組成。在基因治療時(shí)，利用核酶分子結(jié)合到靶分子中適當(dāng)?shù)牟课唬纬慑N頭狀核酶結(jié)構(gòu)，將靶分子切斷，通過(guò)破壞靶分子而達(dá)到治療疾病的目的。（二）核酶()天然核酶多為單一的分核酶錘頭狀的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)只要兩個(gè)分子通過(guò)互補(bǔ)序列相結(jié)合，形成錘頭狀的二級(jí)結(jié)構(gòu)（3個(gè)螺旋區(qū)），并能組成核酶的核心序列（13個(gè)或11個(gè)保守核苷酸序列），就可在錘頭右上方產(chǎn)生剪切反應(yīng)。目錄核酶錘頭狀的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)只要兩個(gè)分1.核酶的設(shè)計(jì)核酶是通過(guò)靶分子與核酶分子共同組成酶活性結(jié)構(gòu)域，要從靶分子和核酶分子兩個(gè)方面來(lái)設(shè)計(jì)核酶。

（1）選擇合適的靶部位，該部位具有核酶切割位點(diǎn)，能與核酶分子結(jié)合并組成酶活性結(jié)構(gòu)域。（2）核酶的基本組成：用于基因治療的核酶分子由三個(gè)部分組成，中間是保守序列（能夠組成酶活性結(jié)構(gòu)域），兩端是引導(dǎo)序列。1.核酶的設(shè)計(jì)核酶是通過(guò)靶分子與核核酶的作用機(jī)制核酶的作用機(jī)制2.核酶的應(yīng)用與一般的反義相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷后，又可從雜交鏈上解脫下來(lái)，重新結(jié)合和切割其它的分子。2.核酶的應(yīng)用與一般的反義相（三）干擾

1干擾現(xiàn)象干擾（，）是一種由雙鏈誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象。在此過(guò)程中，與雙鏈有同源序列的信使（）被降解，從而抑制該基因的表達(dá)。有義（）或反義（）均能抑制線蟲(chóng)基因的表達(dá)，雙鏈比單鏈更為有效。這與傳統(tǒng)上對(duì)反義技術(shù)的解釋正好相反。而且其抑制基因表達(dá)的效率比反義至少高2個(gè)數(shù)量級(jí)。

（三）干擾1干擾現(xiàn)象2干擾的機(jī)制

干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟：

（1）小干擾性（）（2）與細(xì)胞內(nèi)的某些酶和蛋白質(zhì)形成復(fù)合體，稱(chēng)為誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（,)。該復(fù)合體可識(shí)別與有同源序列的，并在特異的位點(diǎn)將該切斷長(zhǎng)雙鏈被細(xì)胞內(nèi)的雙鏈特異性核酸酶切成21~23個(gè)堿基對(duì)的短雙鏈，稱(chēng)為小干擾性（，）2干擾的機(jī)制干擾過(guò)程主要有2個(gè)步驟：（1）小干擾性（）（2干擾機(jī)制示意圖干擾機(jī)制示意圖研究基因功能的新工具

由于干擾技術(shù)具有高度的序列專(zhuān)一性和有效的干擾能力，可以使特定基因沉默或功能喪失，因此可以作為功能基因組學(xué)的一種強(qiáng)有力的研究工具。

干擾技術(shù)能夠在哺乳動(dòng)物中抑制特定基因的表達(dá)，建立多種表型；抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段。

研究基因功能的新工具

由于干擾技術(shù)1.體外化學(xué)合成;2.用質(zhì)粒載體或病毒載體可在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地生成。的產(chǎn)生1.體外化學(xué)合成;的產(chǎn)生四、基因治療的應(yīng)用研究四、基因治療的應(yīng)用研究（一）遺傳病的基因治療研究

(一)遺傳病基因治療必須符合以下要求1.在水平明確其發(fā)病原因及機(jī)制；2.必須是單基因遺傳病，而且屬隱性遺傳；3.該基因的表達(dá)不需要精確調(diào)控；4.該基因能在一種便于臨床操作的組織細(xì)胞中表達(dá)并發(fā)揮其生理作用；5.該遺傳病不經(jīng)治療將有嚴(yán)重后果(如不治療難以存活等)?？晒┻x擇并符合上述4條以上要求的不過(guò)只有30余種遺傳病。（一）遺傳病的基因治療研究(一)遺傳病基因治療必須符合以下要腺苷脫氨酶()和嘌呤核苷磷酸化酶()缺乏癥珠蛋白生成障礙性貧血和血紅蛋白病血友病和其他血漿蛋白缺乏癥苯丙酮酸尿癥和其他先天性代謝缺陷病萊-納()綜合征家族性高膽固醇血癥囊性纖維化病目錄腺苷脫氨酶()和嘌呤核苷磷酸化酶目錄（二）惡性腫瘤基因治療研究

（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入多種抑癌基因以抑制癌癥的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移；腫瘤發(fā)生是一個(gè)極為復(fù)雜的過(guò)程，許多基因的突變會(huì)導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。（2）抑制癌基因的活性，通過(guò)干擾癌基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，發(fā)揮抑癌作用；（3）增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的免疫原性，通過(guò)對(duì)腫瘤組織進(jìn)行細(xì)胞因子修飾，刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生對(duì)腫瘤細(xì)胞的溶解和排斥反應(yīng)；（4）通過(guò)導(dǎo)入“自殺基因”殺傷癌細(xì)胞。（二）惡性腫瘤基因治療研究（1）通過(guò)基因置換和基因補(bǔ)充，導(dǎo)入腫瘤基因治療的常用方法

?基因干預(yù)技術(shù)：通過(guò)基因干預(yù)，抑制腫瘤細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)的癌基因，從而降低其惡性表型。?自