外周血循環(huán)DNA作為生物標志物在卵巢癌臨床中的應用研究-PLOS

外周血循環(huán)DNA作為生物標志物在卵巢癌臨床中的應用研究試驗方案試驗目的：外周血循環(huán)游離DNA作為生物標志物在卵巢癌臨床應用的價值試驗類別：診斷試驗申辦單位：蘇州大學研究單位：蘇州大學附屬第二醫(yī)院試驗負責人：李凱主要研究者：張榮試驗日期：2012年11至2017年11月聯(lián)系人：張榮電話、臨床試驗背景卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，卵巢癌的死亡率居婦科腫瘤首位。70%的患者發(fā)現(xiàn)時已是晚期(Ⅲ期和Ⅳ期)，雖經(jīng)積極治療，5年生存率也僅為15%~20%，若早期(Ⅰ期)發(fā)現(xiàn)，5年生存率可達77%~87%，若為分化良好的Ⅰ期患者，5年生存率可達到94%[1]。因此，提高生存率的關鍵是早期診斷。特異而敏感的腫瘤標記物在輔助診斷卵巢癌中起重要作用。近年來檢測腫瘤患者外周血中游離DNA的改變?yōu)槟[瘤的早期診斷和復發(fā)監(jiān)控提供了一種新的手段。游離DNA可存在于血漿或血清、腦脊液及滑膜液等體液中，是指一種游離于細胞之外的DNA，其中血液中的相應成分又稱循環(huán)游離DNA或循環(huán)DNA。早在1947年Mandel等[2]就發(fā)現(xiàn)了人的血液循環(huán)中存在游離DNA。自1977年leon等[3]發(fā)現(xiàn)腫瘤患者的血漿DNA含量明顯高于正常人后，關于腫瘤患者血中游離DNA的研究逐漸成為人們關注的熱點。對游離DNA的定性研究顯示,腫瘤患者的血漿DNA具有與腫瘤細胞DNA一致的基因異常[4-7]。通過研究發(fā)現(xiàn)，原癌基因的突變，抑癌基因甲基化改變和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性改變[8-9]，可以預測腫瘤患者的預后[10]。目前國外對血中游離DNA的研究多集中在肺癌、直腸癌、乳腺癌、前列腺癌、黑色素瘤等西方國家的“多發(fā)病”上，對卵巢癌的研究不多。Hagiwara等[11]對肺癌吸煙與不吸煙患者及健康人的游離DNA分別進行了p53基因編碼子248和249的突變檢測，認為吸煙者游離DNA中p53基因突變可作為癌癥的預測指標。Ryan等[12]對大量結腸癌患者的游離DNA研究表明，游離DNA中k-ras基因突變的患者腫瘤復發(fā)率可達62.5%。歐洲癌癥和營養(yǎng)學前瞻性隊列研究收集了準健康者至其癌癥發(fā)生后的游離DNA，進行了k-ras基因12位編碼子和p53基因的突變檢測，這一系列研究包括膀胱癌、肺癌、上消化道癌等，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤得到臨床診斷前18.3個月，在血中游離DNA中就可檢測到相應的基因突變，這種可預測性與腫瘤原發(fā)部位、類型和分期相關。Frattini等[13]表明，游離DNA定量、定性及定點的聯(lián)合檢測將提高腫瘤的臨床診斷率。該研究觀察了大腸癌患者手術前后的游離DNA水平和游離DNA中k-ras和p16的變化，發(fā)現(xiàn)術后游離DNA水平逐漸下降，當腫瘤復發(fā)時快速升高，并重新可以檢測到突變的k-ras和p16基因的甲基化。Melnikov[14]等用甲基化特異性PCR檢測了卵巢癌患者手術的腫瘤組織和血漿中的甲基化差異，發(fā)現(xiàn)將BRCA1、HIC1、PAX5、PGR、THBS1基因合并檢測，診斷卵巢癌的敏感性為85%，特異性為61%，其效率與直接應用腫瘤組織相當。Dobrzycka[15]等用PCR-RFLP的方法評價了血漿游離DNA與卵巢癌進展的關系，發(fā)現(xiàn)游離DNA的增加與腫瘤生婦科彩超檢查。3.健康對照組：采集肘靜脈血6ml，用EDTA抗凝，測血漿游離DNA濃度及完整性。每年隨訪一次，共隨訪5年。（二）血漿游離DNA濃度及完整性的檢測標本采集后2h內(nèi)送實驗室。常溫下3000r/min離心10min，小心吸取上清血漿轉移至3ml離心管中，3000r/min離心10min，吸取上清，置-80解凍血漿，血漿DNA抽提采用QIAampBloodMiniKit(Qiagen公司)，按說明書進行。游離DNA濃度及完整性測定：根據(jù)文獻中給出的ALU基因的序列設計兩對引物，一對引物為文獻中已經(jīng)給出的引物，擴增115bp長度，另一對引物自己設計，擴增長度為219bp，均由由上海生工合成。115bp:ALU115-1：CCTGAGGTCAGGAGTTCGAG，ALU115-2：CCCGAGTAGCTGGGATTACA。219bp:ALU219-1：CACGCCTGTAATCCCAGCACTTT，ALU219-2：ATCTCGGCTCACTGCAACCTCC。以提取的血漿DNA為模板，進行PCR擴增。以試劑盒內(nèi)已知的標準品濃度可計算出實驗標本的游離DNA濃度。計算血漿游離DNA完整性：血漿游離DNA完整性=ALU219-qPCR/（ALU115-qPCR+ALU219-qPCR）。檢測血中和卵巢癌手術標本中熱點基因甲基化狀態(tài)：利用高保真DNA聚合酶的作用下巢式PCR的方法，根據(jù)腫瘤相關基因（根據(jù)相關文獻和NCBI中的序列信息）設計引物，做巢式PCR（高保真酶），將得到的PCR產(chǎn)物測序。根據(jù)測序結果再設計引物，進行甲基化特異性熒光定量PCR，提取健康人的、卵巢良性囊腫患者、卵巢癌患者手術前后的血漿游離DNA做模板，兩端設計引物做熒光定量PCR，看不同組之間的游離DNA甲基化的數(shù)量是否有顯著性差異。隨訪觀察：三組實驗對象于隨訪期內(nèi)定期抽血檢測血漿游離DNA濃度及完整性。（三）觀察指標各組血漿游離DNA濃度及完整性、卵巢癌相關基因甲基化狀態(tài)。七、統(tǒng)計分析本試驗統(tǒng)計分析選用符合方案數(shù)據(jù)集，即所有符合試驗方案要求的受試者數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Dunnett’s多組對比、t檢驗、Spearman’s相關性（一致性）檢驗、ROC曲線分析和多分類logistic回歸雙側檢驗。八、試驗段質量控制和保證本研究過程中，將由申請者指派的臨床監(jiān)查員定期對研究醫(yī)院進行現(xiàn)場監(jiān)查訪問，以保證研究方案的所有內(nèi)容都得到嚴格遵守和填寫研究資料的正確。參加研究人員必須經(jīng)過統(tǒng)一培訓，統(tǒng)一記錄方式與判斷標準。整個臨床試驗過程均應在嚴格操作下進行。研究者應按病例報告表填寫要求，如實、詳細、認真記錄CRF中各項內(nèi)容，以確保病例報告表內(nèi)容完整真實、可靠。臨床試驗中所有觀察結果和發(fā)現(xiàn)都應加以核實，以保證數(shù)據(jù)的可靠性，確保臨床試驗中各項結論來源于原始數(shù)據(jù)。在臨床試驗和數(shù)據(jù)處理階段均有相應的數(shù)據(jù)管理措施。九、倫理學要求本臨床試驗必須遵循赫爾辛基宣言和中國有關臨床試驗研究規(guī)范、法規(guī)進行。在試驗開始之前，須經(jīng)蘇州大學附屬第二醫(yī)院倫理委員會批準認定該試驗方案后方可實施。每一位患者入選本研究前，研究醫(yī)師有責任以書面文字形式，向其或其指定代表完整、全面地介紹本研究的目的、程序和可能的風險。應讓患者知道他們有權隨時退出本研究。入選前必須給每位患者一份書面患者知情同意書（以附錄形式包括于方案中）。研究醫(yī)師有責任在每位患者進入研究之前獲得知情同意書，并以研究檔案保留其中。資料保存：使用后銷毀參考文獻：[1]VergoteI,DeBrabanteJ,FylesA,etal.PrognosticimportanceofdegreeofdifferentiationandcystruptureinstageⅠinvasiveepithelialovariancarcinoma[J].Lancet,2001,357(9251):176-82.[2]MandelP,MetaisP.LesacidesnucleiquesduplasmasanguinchezI,home[J].CRAcadSciParis,1948,142:241-43.[3]LeonSA,ShapiroB,SklaroffDM,etal.FreeDNAintheserumofcancerpatientsandtheeffectoftherapy[J].CancerRes,1977,37:646-50.[4]MirzaS,SharmaG,PrasadCP,etal.PromoterhypermethylationofTMS1,BRCA1,EralphaandPRBinserumandtumorDNAofinvasiveductalbreastcarcinomapatients[J].LifeSci,2007,81(4):280-7.[5]WeaverKD,GrossmanSA,HermanJG.MethylatedtumorspecificDNAasaplasmabiomarkerinpatientswithglioma[J].CancerInvest,2006,24(1):35-40.[6]YangHJ,LiuVW,WangY,etal.Detectionofhypermethylatedgenesintumorandplasmaofcervicalcancerpatients[J].GynecolOncol,2004,93(2):435-40.[7]Sanchez-CespedesM,EstellerM,WuL,etal.Genepromoterhypermethylationintumorsandserumofheadandneckcancerpatients[J].CancerRes,2000,60(4):892-95.[8]AnkerP,StrounM.CirculatingDNAinplasmaorserum[J].Medicina(BAires),2000,60(5Pt2):699-702.[9]ShapiroB,ChakrabartyM,CohnEM,etal.DeterminationofcirculatingDNAlevelsinpatientswithbenignormalignantgastrointestinaldisease[J].Cancer,1983,51(11):2116-20.[10]SozziG,ConteD,MarianiL,etal.AnalysisofcirculatingtumorDNAinplasmaatdiagnosisandduringfollow-upoflungcancerpatients[J].CancerRes,2001,61(12):4675-8.[11]HagiwaraN,MechanicLE,TriversGE,etal.Quantitativedetectionofp53mutationsinplasmaDNAfromtobaccosmokers[J].CancerRes,2006,66(16):8309-17.[12]RyanBM,LefortF,McmanusR,etal.AprospectivestudyofcirculatingmutantKRAS2intheserumofpatientswithcolorectalneoplasiastrongprognosticindicatorinpostoperativefollowup[J].Gut,2003,52(1):101-8.[13]FrattiniM,GallinoG,SignoroniS,etal.QuantitativeandqualitativecharacterizationofplasmaDNAidentifiesprimaryandrecurrentcolorectalca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