基因工程疫苗

第五章基因工程疫苗

第一節(jié)疫苗概述一、疫苗的起源與發(fā)展疫苗的起源可以追溯到我國古代。早在4世紀初，東晉葛洪所著《肘后方》中，已有關(guān)于防治狂犬病的記載：“殺所咬犬，取腦敷之，后不復發(fā)”。在宋真宗時代（公元1000年左右）宰相王達之子患了天花，四處請醫(yī)無效，最后請來了峨眉山的道人，取其患處的結(jié)痂，處理后進行自體接種而治愈，這當是最早的自身免疫治療（self-Vaccine）

。

逐漸發(fā)展成了預防天花的人痘接種法，即從感染天花后的恢復期病人或癥狀比較輕的病人身上，挑取水泡、膿皰和痘痂內(nèi)容物并保存1個月左右待其干燥，然后將其研磨成粉末，給健康人的鼻腔吸入，以預防天花，取得了很好的保護效果。這是人類史上最早使用疫苗來預防疾病的記錄，較英國醫(yī)生琴納（Jenner）發(fā)明牛痘苗早了幾百年。

15世紀中期我國的人痘苗接種法傳至中東，后經(jīng)改革進行皮下接種。1721年英駐土耳其的大使夫人，將此法又傳至英與歐洲各國。人痘的發(fā)明是中國人民對世界醫(yī)學的一大貢獻。2000年，美國疾病控制與預防中心（CentersforDiseaseControlandPrevention，CDC）出版了《疫苗可預防疾病的流行病學與預防學》第6版，在這本被譽為疫苗學權(quán)威手冊首頁的“疫苗接種的里程碑”中，第一項即是“12世紀中國開始用人痘接種預防天花”（見表6-1）。這是對中國首先開始使用人痘接種預防天花是最早的免疫接種形式的肯定。

表5-1疫苗發(fā)展史上的里程碑事件

時間事件12世紀中國開始用人逗接種預防天花1721年人逗接種傳入英國1796年E.Jenner為JamesPhipps接種牛痘，疫苗接種正式開始1870L.Pasteur發(fā)明了第一個細菌減毒活疫苗——雞霍亂疫苗1884年L.Pasteur發(fā)明了第一個病毒減毒活疫苗——狂犬病疫苗1885年L.Pasteu第一次把狂犬病疫苗接種于人體1901年VonBehring發(fā)現(xiàn)了白喉抗毒素，獲得第一個醫(yī)學諾貝爾獎1909年Smith發(fā)明了滅活白喉毒素的方法1909年Calmette和Guerin發(fā)明了第一個用于人的細菌減毒活疫苗BCG1933年GoodPasture發(fā)明了雞胚病毒培養(yǎng)法1949年Enders及其同事從人細胞系中分離出脊髓灰質(zhì)炎Ⅱ型Lancing株1954年Enders分離出麻疹病毒1955年脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗獲準生產(chǎn)時間事件1961年人二倍體細胞株建立1963年麻疹疫苗獲準生產(chǎn)三價脊髓灰質(zhì)炎疫苗獲準生產(chǎn)1966年世界衛(wèi)生聯(lián)盟呼吁全球消滅天花1977年索馬里發(fā)現(xiàn)最后一例本土天花1979年美國報道最后一例野毒傳播型脊髓灰質(zhì)炎1986年第一個重組疫苗——重組乙型肝炎疫苗獲準生產(chǎn)1989年推薦使用二劑型麻疹疫苗1990年第一個多糖結(jié)合疫苗——B型流感嗜血桿菌疫苗獲準生產(chǎn)1991年西半球報道最后一例野毒株脊髓灰質(zhì)炎病例乙型肝炎免疫納入全球計劃免疫1994年美國消滅脊髓灰質(zhì)炎得到證實1995年水痘疫苗獲準生產(chǎn)1996年用于嬰兒的無細胞型百日咳疫苗獲準生產(chǎn)1997年推薦進行掃蕩式脊髓灰質(zhì)炎免疫1999年推薦單一使用脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗2000年用于嬰兒的結(jié)合肺炎球菌疫苗獲準生產(chǎn)引自：CDC：EpidemiologyandPreventionofVaccine-preventableDisease.6Edition，200017965.14英國鄉(xiāng)村醫(yī)生愛德華·琴納（EdwardJenner）進行了人類歷史上的第一次疫苗接種試驗。Jenner從一位感染了牛痘的年輕擠奶農(nóng)婦的手上挑取了痘苗接種到一名8歲男孩的手臂上。經(jīng)過幾個月的嚴密觀察，發(fā)現(xiàn)小男孩獲得了免疫保護，一直沒有感染天花。1798年9月，Jenner發(fā)表了接種“牛痘”預防天花的論文，雖然當時全然不知天花是由天花病毒感染所致，但這一劃時代的發(fā)明，開創(chuàng)了人工自動免疫的先河。隨后，種痘技術(shù)傳遍了歐洲，后又傳到北美和亞洲。為紀念Jenner的這一偉大貢獻，巴斯德（Pasteur）將疫苗稱為Vaccine（拉丁文vacc是“?！钡囊馑迹?。由于長期和廣泛地使用牛痘苗，全世界從1977年以后再也沒有發(fā)現(xiàn)過天花病人。世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）于1979年10月26日莊嚴宣布，天花已在全球絕跡。這是人類歷史上第一個使用疫苗消滅的傳染病。19世紀70年代，法國科學家路易斯·巴斯德（LouisPasteur）有關(guān)減毒雞霍亂菌的研究，是繼琴納之后的重大進步。他認為使用減毒的病原體來預防其導致的疾病，比使用相關(guān)的動物病原體來預防人類疾病理當更加有效。巴斯德建立了現(xiàn)代意義上的預防接種，即通過實驗室內(nèi)研制的疫苗來預防傳染病。隨后的羊炭疽減毒活疫苗的試驗成功，尤其是1885年首次在人體使用減毒狂犬病疫苗的成功，標志人類進入了一個預防接種的科學新紀元?；诎踩?，正式生產(chǎn)的均為狂犬病滅活疫苗，質(zhì)量上也在不斷的改進。Pasteur在疫苗研制領(lǐng)域的先鋒作用和卓越貢獻引起了第一次疫苗革命。到19世紀末，人類在疫苗學領(lǐng)域里已經(jīng)取得了輝煌的成就，包括2個人用病毒減毒活疫苗（琴納的牛痘，巴斯德的狂犬病），3個人用細菌滅活疫苗（美國Salmon和Smith、法國Chamberlai和Roux的傷寒、霍亂和鼠疫），以及疫苗學的一些基礎(chǔ)概念，如Metchnikoff的的細胞免疫（1884年），Ehrlich的受體理論（1897年）及毒素-抗毒素作用。進入20世紀前30年，疫苗學在三個方面取得了重大進展：首先，法國科學家Calmette和Guerin在1906年從牛體分離到1株結(jié)核菌，經(jīng)過13年在牛膽汁中傳遞230代，獲得1株減毒株，制成疫苗，于1927年上市，即所謂卡介苗（BCG）。其次，在20年代，巴斯德研究所的Ramon應用化學滅活方法獲得白喉和破傷風類毒素并研制成疫苗。第三，WilsonSmith和ThomasFrancis分別在禽胚中研制成功2種滅活甲型流行性感冒（流感）疫苗。二次大戰(zhàn)后，疫苗研究進入了突飛猛進的發(fā)展階段。波士頓的Enders及其同事發(fā)展了病毒的體外細胞培養(yǎng)技術(shù)，促進了多種減毒和滅活病毒疫苗的研制。50年代，先有Salk的3價滅活脊髓灰質(zhì)炎（脊灰）疫苗（IPV），后有Sabin的3價減毒脊灰疫苗（OPV），為人類渴望在地球上消滅脊灰提供了有力武器。同一時期還研制了在雞胚細胞中培養(yǎng)減毒的麻疹疫苗。60年代研制了在雞胚中減毒的流行性腮腺炎疫苗。70年代研制了在細胞中培養(yǎng)的風疹疫苗。細菌疫苗方面，70年代細菌夾膜多糖的純化技術(shù)促進了多個侵襲性細菌疫苗的研制成功。同一時期的病毒蛋白純化技術(shù)也促進了血源性乙型病毒性肝炎（乙肝）疫苗的研制成功。20世紀80年代，現(xiàn)代分子技術(shù)的應用推動了又一代疫苗的研制，引發(fā)了疫苗發(fā)展史上的第二次革命，其首要成果是基因重組乙肝疫苗，為人類在地球上消除乙肝提供了希望。與此同時，化學、生物化學、遺傳學和免疫學的發(fā)展在很大程度上為新疫苗的研制和舊疫苗的改進提供了新技術(shù)和新方法（表5-2）。表5-2新技術(shù)對疫苗研制和開發(fā)的作用及影響

學科領(lǐng)域生物技術(shù)作用和影響遺傳學基因工程和DNA重組（包括基因克隆和表達，DNA測序，DNA合成，核酸內(nèi)切酶和工具酶，PCR，全基因圖譜）抗原鑒定和抗原分離測定抗原的可變性蛋白質(zhì)抗原的基因工程基因突變和減毒重組微生物作為載體化學多肽合成鑒定抗原表位研制多肽疫苗蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)計數(shù)及估測T和B細胞表位糖結(jié)構(gòu)多糖疫苗基礎(chǔ)研究佐劑，多糖和蛋白質(zhì)偶聯(lián)疫苗免疫學單克隆抗體抗原鑒定和抗原分離鑒定抗原表位抗同種異型模擬非蛋白質(zhì)表位免疫調(diào)控新型佐劑基礎(chǔ)研究細胞和分子免疫機理粘膜免疫至今已有30余種疫苗成功的用于人類疾病的預防（表5-3）。其中一半以上是病毒疫苗。如天花（poxvirus）、小兒麻痹（poliovirus）、麻疹（Measles）等曾嚴重危害人類生命與健康的疾病的流行得到了有效的控制。其中天花已被根除，創(chuàng)造了使用疫苗在自然界中徹底消滅一種病原微生物的醫(yī)學奇跡。人類消滅脊髓灰質(zhì)炎的目標也即將實現(xiàn)。表6-3人用疫苗發(fā)展年表應用年份疾病名稱疫苗類型1721天花“人痘”活天花病毒1796天花“天然減毒”痘苗病毒1885狂犬病“不同程度”減毒的滅活病毒1936黃熱病活減毒病毒1936流感滅活全病毒1943流感滅活完整（whole）病毒1955小兒麻痹滅活病毒1957狂犬病滅活病毒、鴨胚培養(yǎng)1961小兒麻痹活減毒病毒1963麻疹滅活病毒和減毒活病毒1967腮腺炎活減毒病毒1969風疹活減毒病毒表6-3人用疫苗發(fā)展年表應用年份疾病名稱疫苗類型1972流腦純化多糖A和C型1974日本腦炎（乙腦）滅活病毒1976狂犬病滅活病毒、人二倍體細胞培養(yǎng)1981乙型肝炎滅活、血源苗1982腦膜炎球菌腦膜炎純化A、C、Y、W135型多糖1983日本腦炎（乙腦）活減毒病毒1983水痘活減毒病毒1986乙型肝炎基因重組蛋白質(zhì)疫苗1991甲型肝炎活減毒病毒和滅活病毒1998輪狀病毒腹瀉活減毒病毒1998回歸熱純化蛋白質(zhì)疫苗我國自1919年開始建立專門的機構(gòu)（中央防疫處，北京生物制品研究所前身）從事生物制品的研究、生產(chǎn)，這是我國第一所生物制品研究所。建國后，我國政府重新組建和新建了北京、上海、武漢、長春、蘭州、成都等六個生物制品研究所。中國現(xiàn)有疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)約30家，是世界上疫苗產(chǎn)品生產(chǎn)企業(yè)最多的國家（表5-4）。中國的疫苗產(chǎn)品年產(chǎn)量已經(jīng)超過10億個劑量單位，疫苗的種類和數(shù)量也達到世界之最，其中用于預防乙肝、脊髓灰質(zhì)炎、麻疹、百日咳、白喉、破傷風的兒科常見病的疫苗生產(chǎn)量達到5億人份，已經(jīng)全部實現(xiàn)計劃免疫接種。中國生產(chǎn)的疫苗產(chǎn)品已經(jīng)能夠滿足防病、滅病的需要。表6-4中國主要疫苗種類和生產(chǎn)廠家

種類制品名稱用途生產(chǎn)廠家病毒類重組酵母基因工程乙肝疫苗用于預防所有已知亞型的乙肝病毒的感染。北京天壇生物、深圳康泰重組（CHO）乙型肝炎疫苗預防乙型肝炎病毒感染長春所、蘭州所、華北制藥甲型肝炎純化滅活疫苗（VAQTA）VAQTA適用于接觸前的主動免疫，以預防甲型肝炎病毒引起的肝炎，但不能預防由非甲型肝炎病毒引起的肝炎。首次免疫應在預計接觸前至少2周進行。巴斯德-梅里厄-康納公司、北京科興甲型肝炎減毒疫苗用于預防甲型肝炎史克必成公司、長春所、長春高新種類制品名稱用途生產(chǎn)廠家風疹減毒活疫苗年齡為8個月以上的風疹易感者巴斯德-梅里厄-康納公司、蘭州所、天壇生物、上海所麻疹減毒活疫苗預防麻疹病蘭州所、長春所、上海所森林腦炎滅活疫苗用于預防森林腦炎長春所乙型腦炎滅活疫苗本疫苗免疫接種后，刺激機體產(chǎn)生抗乙型腦炎病毒的免疫力，用于預防乙型腦炎。蘭州所、長春所、天壇生物、上海所Ⅰ型腎綜合征出血熱純化疫苗預防流行性出血熱蘭州所、上海所Ⅱ型腎綜合征出血熱純化疫苗預防Ⅱ型出血熱長春所流行性感冒滅活疫苗6歲以上所有希望預防流感的健康人群巴斯德-梅里厄-康納公司、史克必成公司、蘭州所、長春所、長春高新腮腺炎減毒活疫苗8月齡以上的腮腺炎易感者蘭州所、上海所種類制品名稱用途生產(chǎn)廠家口服脊髓灰質(zhì)炎減毒活疫苗預防脊髓灰質(zhì)炎天壇生物口服輪狀病毒活疫苗預防小兒秋季腹瀉蘭州所水痘減毒活疫苗12月齡以上的水痘易感者長春生物制品研究所、史克必成公司、長春所、上海所人用狂犬病純化疫苗用于預防狂犬病巴斯德-梅里厄-康納公司、蘭州所、長春所、成都所黃熱減毒活疫苗預防黃熱病天壇生物聯(lián)合疫苗吸附白喉、破傷風、百日咳和脊髓灰質(zhì)炎疫苗該聯(lián)合疫苗適用于兒童預防白喉、破傷風、百日咳和脊髓灰質(zhì)炎的基礎(chǔ)免疫及加強免疫。巴斯德—梅里厄—康納公司麻疹、流行性腮腺炎和風疹疫苗預防麻疹、流行性腮腺炎、風疹默沙東公司、史克必成公司甲乙肝聯(lián)合疫苗預防甲肝和乙肝史克必成公司、北京科興二、疫苗與基因工程疫苗

傳統(tǒng)疫苗（TraditionalVaccine）用人工變異或從自然界篩選獲得的減毒或無毒的活的病原微生物制成的制劑或者用理化方法將病原微生物殺死制備的生物制劑，用于人工自動免疫以保護人或動物產(chǎn)生免疫力，這些制劑被稱為疫苗（多用于預防），即疫苗是由病原體制成的。國內(nèi)常將細菌制作的人工主動免疫生物制品稱為菌苗。將病毒（Virus）、立克次氏體（Rickettia）、螺旋體（Spiralcoil）等微生物制成的生物制品稱為疫苗。現(xiàn)在國際上一般將細菌性制劑、病毒性制劑以及類毒素統(tǒng)稱為疫苗（vaccine）?；蚬こ桃呙纾荷鲜霆M義的疫苗被稱做傳統(tǒng)疫苗（traditionalvaccine），即完整的病原體為主制成的疫苗；而基因工程疫苗則屬于新一代疫苗（NewgenerationVaccine）或高技術(shù)疫苗范疇（High-techVaccine）。主要包括基因工程亞單位疫苗、基因工程載體疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗、蛋白工程疫苗等等，廣義的還包括遺傳重組疫苗、合成肽疫苗、抗獨特型抗體疫苗以及微膠囊可控緩釋疫苗等?，F(xiàn)代疫苗（Modernvaccine）：是一種利用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)使用Ag通過誘發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫反應以予防和治療疾病或達到某種特定的醫(yī)學目的生物制劑。

三、傳統(tǒng)疫苗與新型疫苗的區(qū)別：傳統(tǒng)疫苗①疫苗的研制則主要是通過人體實驗從經(jīng)驗與失敗中獲得。②20世紀以來，隨著病原學、流行病學、免疫學，特別是病毒組織培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，大量傳統(tǒng)疫苗相繼問世。③免疫學的進展，使人們可以通過是否產(chǎn)生中和抗體判定疫苗成功與否。幾乎所有免疫保護機制明確，可以產(chǎn)生中和抗體，又易于培養(yǎng)的疫苗都已獲得成功。甚至一些新出現(xiàn)的疾病，主要具備上述特點，也可以使用傳統(tǒng)疫苗技術(shù)迅速研制成功（表5-5）。④對于免疫保護機制不明確，有潛在致癌性或免疫病理作用，以及病原不能或難于培養(yǎng)的疫苗，使用傳統(tǒng)疫苗技術(shù)就很難研制成功。新型疫苗①新型疫苗則是在分子生物、分子免疫學、蛋白化學以及相應的生物高技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的（Woodrow，1997）。②重組DNA技術(shù)包括促進了疫苗生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展。

③從現(xiàn)代的觀點來看，我們可以把疫苗定義為：一種使用抗原通過誘發(fā)機體產(chǎn)生特異免疫反應以預防和治療疾病或達到特定醫(yī)學目的的生物制劑。④目前新型疫苗的研究主要集中在改進傳統(tǒng)疫苗和研制傳統(tǒng)技術(shù)不能解決的新疫苗兩個方面，包括腫瘤疫苗、避孕疫苗及其它非感染性疾病疫苗的研究，其中發(fā)展治療性疫苗已成為新型疫苗研究的重要組成部分。疫苗類型國內(nèi)外生產(chǎn)狀況國內(nèi)國外1小兒麻痹（OPV）減毒活疫苗（I-III型聯(lián)合）+-小兒麻痹（IVP）滅活疫苗（I-III型聯(lián)合）+-2麻疹減毒活疫苗++3卡介苗（BCG）減毒活疫苗++4白喉-百日咳-破傷風（DPT）亞單位疫苗（聯(lián)合）++亞單位疫苗（基因工程P）-+5

乙型肝炎亞單位疫苗（血源）++亞單位疫苗（基因工程CHO）+（S）+（S2）亞單位疫苗（基因工程酵母）+（引進）+6乙腦減毒活疫苗+-滅活疫苗++7流腦亞單位疫苗（多糖）++8甲肝減毒活疫苗++滅活疫苗-+9流感滅活疫苗++減毒活疫苗（遺傳重配）-+10狂犬滅活疫苗++11風疹減毒活疫苗++12腮腺炎減毒活疫苗++麻疹-風疹-腮腺炎（MMR）減毒活疫苗（三種聯(lián)合）-+13出血熱滅活疫苗++14腺病毒（Ad4，Ad7）減毒活疫苗-+15水痘減毒活疫苗-+16黃熱病減毒活疫苗++17輪狀病毒腹瀉減毒活疫苗（人猴遺傳重配）-+減毒活疫苗（人羊遺傳重配）+-18傷寒滅活疫苗++減毒活疫苗（Ty21a）-+19鉤端螺旋體滅活疫苗+-20霍亂亞單位+滅活（CTB+WC）-+亞單位+滅活（基因工程CTB+WC）++減毒活疫苗（基因工程CBV-HgR）-+21鼠疫減毒活疫苗++22斑疹傷寒滅活疫苗++23布氏桿菌減毒活疫苗++24炭疽桿菌減毒活疫苗++25痢疾減毒活疫苗（基因工程FS）+-26鏈球菌肺炎亞單位疫苗（多糖）-+27噬血桿菌流感亞單位疫苗（多糖）-+28痘苗（天花）減毒活疫苗+*+*注：“+”為已投入生產(chǎn)，“-”為未生產(chǎn)，“*”為已停止生產(chǎn)第二節(jié)病毒疫苗的種類一、傳統(tǒng)病毒疫苗

又稱常規(guī)疫苗或第一代疫苗，是長期以來用于傳染病預防的主要生物制品。1、滅活疫苗（deadVaccine）

滅活疫苗又稱死疫苗，是指利用加熱或甲醛等理化方法將人工大量培養(yǎng)的完整的病原微生物殺死，使其喪失感染性和毒性而保持其免疫原性，并結(jié)合相應的佐劑而制成的疫苗。疫苗液中除含有滅活的病毒顆粒外，還含有細胞成分和培養(yǎng)病毒時加入的牛血清等蛋白類物質(zhì)，多次接種疫苗容易發(fā)生過敏反應。優(yōu)點制造工藝簡單免疫原性的穩(wěn)定性高易于制備多價疫苗缺點：1）需要嚴格的滅活操作，保證疫苗中不含有滅活不完全的顆粒。2）滅活疫苗所提供的免疫力較短暫，為完成免疫程序，需要進行多次接種，由于機體反復接受疫苗中的異性蛋白質(zhì)的刺激，而可能出現(xiàn)不良的過敏反應。3）有些滅活疫苗，如早年制備的麻疹滅活疫苗，可使有些受接種者在以后自然接觸麻疹病毒時，引起嚴重的麻疹感染過敏性反應。4）滅活疫苗雖可刺激機體產(chǎn)生IgM和IgG抗體，但有時卻得不到滿意的保護效果。2、減毒活疫苗（attenuatedvaccine）減毒活疫苗又稱弱毒疫苗，是指將微生物的自然強毒株通過物理、化學和生物學的方法，連續(xù)傳代，使其對原宿主喪失致病力，或只引起亞臨床感染，但仍保持良好的免疫原性、遺傳特性，用這種毒株制備的疫苗就叫減毒活疫苗。當前使用的病毒疫苗多數(shù)是減毒活疫苗。活疫苗具有可誘發(fā)全面的免疫應答反應（體液免疫和細胞免疫）、免疫力持久等優(yōu)點。常用的減毒方法有以下幾種：1）體外減毒即體外連續(xù)傳代減毒。在異源宿主中連續(xù)傳代；在單一宿主中反復連續(xù)傳代。2）冷適應篩選溫度可以改變病毒的特性，得到冷適應株。病毒冷適應株常伴有毒力減弱和各種特征性標志。冷適應篩選穩(wěn)定的減毒突變株是在傳統(tǒng)疫苗設(shè)計中較早采用的方法，而且也是最為行之有效的思路。減毒活疫苗與滅活疫苗各有優(yōu)缺點。前者優(yōu)于后者。減毒活疫苗可使機體產(chǎn)生亞臨床感染，特別當以自然途徑，如口服或噴鼻免疫時，可產(chǎn)生廣譜的免疫應答，即除循環(huán)性抗體IgM和IgG外，在病毒侵入的門戶如呼吸道和消化道也可誘生局部抗體IgA。

3、亞單位疫苗（subunitvaccine）亞單位疫苗是指提取或合成細菌、病毒外殼的特殊蛋白結(jié)構(gòu)，即抗原決定簇制成的疫苗，這類疫苗不是完整的病毒，是病毒的一部分物質(zhì)，故稱亞單位疫苗。亞單位疫苗僅有幾種主要表面蛋白，因而能消除病毒（或細菌）的許多無關(guān)抗原決定簇和粗制或半提純的病毒（或細菌）制劑誘發(fā)的不良反應。

第三節(jié)基因工程病毒疫苗的開發(fā)現(xiàn)狀一、急需研制的基因工程病毒疫苗急需研制的基因工程病毒疫苗主要有十幾種疾病-預防性疫苗治療性疫苗艾滋病+（需要）+乙型肝炎++丙型肝炎++戊型肝炎+-（不需要）EBV肝炎++表4-2需要研制的基因工程病毒疫苗人乳頭瘤病毒感染（宮頸癌）++單純皰疹病毒感染（Ⅰ、Ⅱ型）++巨細胞病毒感染++呼吸道和細胞病毒感染+-輪狀病毒感染+-登革熱病毒感染+-埃博拉病毒感染+-注：“+”表示需要，“-”表示不需要

二、值得使用基因工程技術(shù)進行改造的傳統(tǒng)病毒疫苗對那些免疫保護效果差，或副反應較大，或成本較高，或使用不方便的傳統(tǒng)疫苗，使用基因工程技術(shù)對其改造，或用基因工程疫苗取而代之，將具有極大的市場前景。傳統(tǒng)疫苗可能使用的基因工程疫苗類型流感基因缺失活疫苗，遺傳重組活疫苗甲型肝炎重組活疫苗，亞單位疫苗（病毒樣顆粒）乙型腦炎基因缺失活疫苗水痘重組活疫苗，基因缺失活疫苗麻疹重組活疫苗，基因工程亞單位疫苗黃熱重組活疫苗狂犬（人和獸）重組活疫苗，亞單位疫苗（病毒樣顆粒）出血熱基因缺失活疫苗腺病毒遺傳重配活疫苗，重組活疫苗輪狀病毒亞單位疫苗（病毒樣顆粒）聯(lián)合疫苗重組多價活疫苗，亞單位聯(lián)合疫苗表5-3值得使用基因工程技術(shù)進行改造的傳統(tǒng)病毒疫苗

三、重要病毒性疾病基因工程疫苗研究進展目前，病毒基因工程疫苗主要集中在研制常規(guī)技術(shù)不能或很難解決的新疫苗和改造免疫保護效果差，負反應較大，或成本較高，或使用不方便的傳統(tǒng)疫苗上，有的疫苗兼有預防和治療兩種功能現(xiàn)將我國重要的病毒病基因工程疫苗研究狀況概述如下（參見表5-4）。疫苗及靶抗原疫苗類型研究開發(fā)現(xiàn)狀國內(nèi)國外1艾滋病毒苗—env.gag.pol.nef.v3亞單位多肽（細胞）亞單位多肽（酵母）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（痘苗）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（細胞）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（ALVAC）研究研究研究研究研究研究研究——Ⅱ期Ⅱ期Ⅱ期Ⅰ期研究研究Ⅰ期Ⅰ期表5-4我國重要病毒病基因工程疫苗研究開發(fā)狀況完整病毒顆粒減毒活疫苗（SIV）滅活疫苗（SIV）減毒活疫苗（HIV）減毒活疫苗（HLIV）DNA疫苗————研究——研究Ⅰ期Ⅰ期（動物）研究研究Ⅰ期聯(lián)合免疫多肽+痘病毒DNA+痘病毒研究研究Ⅰ期研究2乙肝疫苗—S亞單位顆粒（酵母）亞單位顆粒（CHO）亞單位顆粒（痘苗）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）亞單位顆粒（植物）DNA疫苗引進生產(chǎn)生產(chǎn)Ⅰ期研究研究研究生產(chǎn)研究研究研究Ⅰ期Ⅰ期研究—S2+S亞單位顆粒（CHO）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究生產(chǎn)研究研究—S1+S2+S亞單位顆粒（CHO）亞單位顆粒（酵母）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究I期Ⅲ期研究研究—Epitop(S1,S2,S)載體活疫苗（沙門菌）研究I期—C亞單位顆粒（大腸）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究3丙肝疫苗——C+E1+E2亞單位多肽（CHO）DNA疫苗研究研究研究研究4戊肝疫苗——ORF2,3亞單位多肽（大腸）亞單位多肽（酵母）亞單位多肽（昆蟲）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究5呼吸道合胞病毒疫苗—F+G載體活疫苗（痘苗）載體活疫羈（Ad4）研究研究研究研究—F亞單位多肽（大腸）研究Ⅱ期6巨細胞病毒疫苗——完整病毒顆粒減毒活疫苗（Towne）基因缺失活疫苗————II期研究7單純皰疹病毒疫苗——完整病毒顆粒基因缺失活疫苗——I期——gD,gB載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究8登革熱病毒疫苗——Dengnel,2,3,4E,Prem-E,NS1,NS2減毒活疫苗分子減毒活疫苗亞單位多肽（痘苗）亞單位多肽（昆蟲）亞單位多肽（原核）亞單位顆粒（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究研究研究Ⅱ期研究研究研究研究研究研究研究研究9乳頭瘤病毒疫苗——L1、L2、E6、E7載體活疫苗（痘苗）亞單位顆粒（酵母）亞單位顆粒（昆蟲）亞單位顆粒（原核）DNA疫苗研究研究研究研究研究研究研究II期研究研究——E6、E7載體活疫苗（痘苗）研究I期10EB病毒疫苗——gp350,LMP1,LM2,C—Epitop載體活疫苗（痘苗）業(yè)單位多肽（合成）亞單位多肽（CHO）亞單位多肽（昆蟲）免疫細胞苗（樹突）DNA疫苗I期研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究研究11甲肝疫苗——ORF載體活疫苗（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）I期研究研究研究——VP1，VP3亞單位多肽（大腸）載體活疫苗（polio）研究研究研究研究12麻疹疫苗—HA+F載體活疫苗（ALVAC）載體活疫苗（痘苗）DNA疫苗——I期研究I期研究研究—完整病毒基因缺失活疫苗研究研究13出血熱疫苗—G1，G2，NP載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）亞單位顆粒（痘苗）亞單位顆粒（昆蟲）研究研究研究研究I期——研究研究14小兒輪狀病毒疫苗—人/猴病毒重組減毒活疫苗（重配）——IV期—人/牛病毒重組減毒活疫苗（重配）——III期—人/羊病毒重組減毒活疫苗（重配）IV期———VP4，VP7，VP6亞單位顆粒（昆蟲）載體活疫苗（原核）載體活疫苗（痘苗）載體活疫苗（Ad）研究——研究研究研究研究研究研究15狂犬病疫苗—外膜糖蛋白載體活疫苗（痘病毒）研究IV期（動物）載體活疫苗（Ad）研究研究多價疫苗—DTP+HBV，DTP+IVP，DTP+IVP+HBVDTP+HBV+HAV聯(lián)合疫苗（傳統(tǒng)技術(shù)+基因工程）研究II期16—甲肝、乙肝、麻疹、RSV載體活疫苗（痘苗）多價DNA疫苗研究研究研究研究艾滋病（AIDS）疫苗

HIV共有9個基因：

3個結(jié)構(gòu)基因：gag、pol、env；

6個調(diào)節(jié)基因：tat、rev、nef、vif、vpu/vpx、vpr1、艾滋?。ˋIDS）疫苗（1）研究的三階段：①最早使用其膜抗原gp120（Glucoseprotein120）②膜抗原加其他能誘發(fā)細胞免疫抗原的多抗原疫苗的復雜設(shè)計；③在泰國使用gp120亞單位疫苗數(shù)千人免疫接苗無效后，改為先用重組痘病毒ALVA（疫苗注射后），再使用gp120亞單位疫苗加強，80%以上的人產(chǎn)生了特異的體液和細胞免疫反應。（2）HIV感染特點：①HIV直接感染破壞免疫細胞；②HIV變異極快。（3）AIDS疫苗研究方向：①能誘發(fā)有效的中和抗體，阻止或大部阻止HIV感染免疫細胞；②能誘發(fā)強細胞免疫；③中和抗體屏障被部分突破時能有效清除被感染細胞，是研究中應統(tǒng)籌考慮的。2、乙型肝炎病毒（HBV）疫苗乙型肝炎病毒

（HEPATITISBVIRUS）形態(tài)結(jié)構(gòu)：乙肝患者血清中發(fā)現(xiàn)3種相關(guān)顆粒小球形顆粒：HBsAg

不含核酸管形顆粒：小球形顆粒串連成大球形顆粒：為完整的病毒顆粒，具傳染性（DANE顆粒）:DNA、逆轉(zhuǎn)錄酶HBVHBV形態(tài)結(jié)構(gòu)大球形顆粒（Dane顆粒）小球形顆粒管形顆粒HBV的小球形顆粒HBV的管形顆粒Dane顆粒HBV的抗原組成表面抗原HBsAg核心抗原HBcAg

e抗原HBeAg表面抗原HBsAg存在于三型顆粒中是HBV感染的主要標志分亞型（a,d/y,w/r,adr）產(chǎn)生抗-HBs具有免疫保護作用疫苗接種成功HBcAg乙肝●HBcAg主要存在于HBV感染的肝細胞內(nèi)或DANE顆粒核心中，到血液中即被降解為HBeAg。一般血清學方法檢測不到HBcAg，而只能檢測到抗-HBc（6）抗-HBc抗HBc-IgM：是HBV近期感染或慢性感染者病毒活動的標志,病毒在復制抗HBc-IgG：凡“有過”HBV感染者均可陽性HBcAg的免疫原性最強持續(xù)時間：6～18個月可終身陽性e抗原HBeAg僅存在于Dane顆粒中游離存在于血液中為病毒復制及強傳染性的指標產(chǎn)生抗－HBe，是預后良好的征象乙肝血源性疫苗，基因工程疫苗（酵母系統(tǒng)、哺乳動物細胞系統(tǒng)）（1）目前存在的問題：人群中約10%左右對現(xiàn)有乙肝疫苗（僅含S抗原的疫苗）無反應；（2）研制方向：使用含前S（主要是前SI）的新一代乙肝基因工程疫苗，可使對現(xiàn)有S乙肝疫苗無反應的人群產(chǎn)生良好的免疫反應。目前，含前S的疫苗，新佐劑乙肝疫苗，乙肝抗原抗體復合物疫苗，治療性乙肝研究的熱點。（3）丙型肝炎病毒（HCV）疫苗

丙型肝炎感染約占人群2%左右，也就是有2000多萬感染者，大部分都會轉(zhuǎn)為慢性，并導致肝硬化和肝癌，危害遠大于乙肝。研究方向；①多數(shù)實驗集中于使用病毒外膜蛋白E1+E2研制病毒樣顆粒的亞單位疫苗和②使用載體進行重組活疫苗研究。③由于丙肝病毒變異快，極易沖破已有中和抗體的屏障，④選擇變異不大且能誘發(fā)細胞免疫的抗原是目前研究的重要的方向之一。4、戊型肝炎病毒（HEV）疫苗戊型肝炎病毒屬杯狀病毒科，單股正鏈RNA病毒，基因組全長約7.4kb。經(jīng)消化道傳播，暴發(fā)流行和散發(fā)兩種，戊型肝炎的臨床表現(xiàn)比甲型肝炎重。選擇基因工程的手段研制戊型肝炎疫苗唯一的方法?；蚬こ桃呙缰饕捎迷思毎?、酵母細胞和昆蟲細胞三種表達體系。

我國目前以原核細胞和酵母細胞對戊型肝炎病毒結(jié)構(gòu)蛋白均表達成功（張明程，1999）抗原性在世界范圍內(nèi)穩(wěn)定，表明戊型肝炎病毒基因工程疫苗將對該病的預防具有良好的效果。

包括正粘病毒科流行性感冒病毒副粘病毒科呼吸道合胞病毒、麻疹病毒其他呼吸道病毒腺病毒主要以呼吸道為侵入門戶5、呼吸道感染病毒對粘蛋白具有特殊親和力的一類RNA病毒1918-1919第一次世界大戰(zhàn)期間，發(fā)生一次大流行，當時全世界20億人口，10億被感染死亡人數(shù)2000萬，超過一戰(zhàn)中死亡人數(shù)的總和最嚴重的一次流行20世紀5次大流行：1900、1918、1957、1968、1977

核心：負單股RNA、7~8個節(jié)段（易變異原因）內(nèi)層：核衣殼核蛋白（NP）RNA多聚酶

中層：內(nèi)膜蛋白（M蛋白）外層：包膜，雙層脂質(zhì)

其上有刺突：血凝素HA神經(jīng)氨酸酶NA流感病毒的結(jié)構(gòu)組成生物學性狀（二）抗原性與分型1、內(nèi)部抗原（核蛋白和內(nèi)膜蛋白）抗原性穩(wěn)定，分甲A、乙B、丙C三型2、表面抗原：HA、NA分亞型(subtype)依據(jù)易變異生物學性狀流感病毒的表示方法A/Bangkok/1/79(H3N2)最先分離的地區(qū)最先分離的日期抗原（三）變異性與流感流行

抗原性易變異是流感V最突出的特性

1、抗原漂移antigendrift：抗原變異幅度小，屬于量變，中小型流行，每年有發(fā)生。變異機理：編碼血凝素基因發(fā)生一系列點突變，（某一核苷酸的堿基發(fā)生改變）導致氨基酸序列改變。生物學性狀2、抗原性轉(zhuǎn)變antigenshift：變異幅度大，質(zhì)變，大流行。每10-40年出現(xiàn)一次。變異機理：基因重組(交換核酸片斷）

生物學性狀

5.呼吸道合胞病毒（RSV,Respiratorysyncytialvirus）疫苗

呼吸道合胞病毒屬單股副鏈RNA病毒，是引起嬰幼兒肺炎的主要病因。

RSV保護性抗原主要是其糖蛋白F和G，高度糖化蛋白，抗原結(jié)構(gòu)復雜，屬結(jié)構(gòu)依賴性抗原，產(chǎn)生中和抗體的能力都很差，給研制RSV蛋白亞單位疫苗帶來了一定困難。

研制方向：目前研制的高度減毒的非復制型載體是研制該疫苗的重要途徑；

制備減毒活疫苗是RSV疫苗研制的另一個重要途徑;

負鏈RNA病毒cDNA轉(zhuǎn)染技術(shù)的成功給使用現(xiàn)代分子生物學技術(shù)制備RSV的分子減毒活疫苗帶來了希望，也是目前RSV疫苗研制重要途徑。6、人巨細胞病毒（HMV）疫苗（1）危害：HMV屬皰疹病毒科，通常為隱性感染，無明顯臨床癥狀。然而HMV的潛伏感染將對人體健康造成極大威脅。（2）問題：該疫苗株雖能誘發(fā)體液和細胞免疫，但保護作用不強，且其潛在的致癌性，以及尚未能最終排除的潛伏感染性，使該類活疫苗尚未能廣泛使用。（3）研制方向：

目前使用分子生物學技術(shù)，有目的地去除與與毒力、潛伏及腫瘤相關(guān)基因的分子減毒疫苗株正在研制中。基因工程技術(shù)表達的gB做亞單位疫苗或重組活疫苗的研究已成為目前HMV疫苗研究的一個重要方向。7、單純皰疹病毒（HSV）疫苗（1）危害：單純皰疹病毒有兩種類型（HSVI和HSVII），在人群中感染相當廣泛。HSVI人群感染率高到50%-90%，多為隱性潛伏性感染。母嬰傳播中皰疹性角膜炎視力障礙新生兒死亡率高達60%。在病毒性腦炎中，HSVI型感染引起的占10%。HSVII主要經(jīng)過性傳播，病毒檢出率可達5%-12%。HSVII感染是宮頸癌的重要誘因之一。（2）方向：

病毒糖蛋白gD和gB是主要的保護性抗原，與gC、gE、gI聯(lián)合使用可誘生體液和細胞免疫，在動物實驗中，HSVIIgD的核酸疫苗可以保護動物免受感染及隨后的潛伏感染，這些研究為單純皰疹病毒疫苗的研究提供了有力的證據(jù)。8、登革熱病毒疫苗（Denguefevervirusvaccine）（1）危害：登革熱病毒屬黃病毒科，為單股正鏈RNA病毒，有4個血清型，蚊子叮咬傳播給人，在我國南方熱帶亞熱帶地區(qū)發(fā)生過多次登革熱流行。（2）方向：

①通過表達prM-E形成病毒樣顆粒的亞單位疫苗顯示了較好安全性和免疫保護性，是該疫苗研究的重要方向。②使用該病毒感染性cDNA進行的分子減毒活疫及多種亞型嵌合的減毒活疫苗研究也取得了較好效果，是另一個重要途徑。

9、人乳頭瘤病毒（Humanpapillomavirus，HPV）疫苗人乳頭瘤病毒是環(huán)型雙鏈dsDNA病毒，其中與宮頸癌密切相關(guān)的有HPV16、18、33、58等亞型。外殼蛋白L1和L2能誘發(fā)機體產(chǎn)生體液和細胞免疫，預防乳頭瘤病毒感染；E6和E7是與細胞轉(zhuǎn)化有關(guān)的蛋白，表達E6和E7的重組痘病毒疫苗能有效阻止HPV陽性的宮頸癌細胞生長和轉(zhuǎn)移。表達HPV16和HPV18兩型E6和E7的重組痘苗病毒已進行了小量人體觀察，證明產(chǎn)生了部分抑制腫瘤生長的結(jié)果（1996）。L1和L2可在細菌、酵母及痘苗病毒載體中很好表達，并形成病毒樣顆粒，有很好的安全性和免疫效果。治療性疫苗以E6和E7為主，加上L1和L2可增強治療性疫苗免疫效果。10、Epstein-Barr病毒（EB）疫苗（1）危害：EB病毒為皰疹病毒科，嗜淋巴細胞病毒屬，感染廣泛，90%以上成人都感染過此病毒。（2）方向：①阻斷其原發(fā)感染；②清除鼻咽癌細胞。

（3）方法：前者主要以EBV的MA（如gp350）為免疫原，gp350亞單位疫苗和表達gp350的重組痘苗病毒活疫苗顯示了一定抗瘤作用；后者主要以EBV的潛伏膜蛋白LMP1和LMP2為免疫原，進行了多肽、重組活疫苗、DNA疫苗免疫細胞疫苗等多種嘗試。11、埃博拉病毒（EBV）疫苗vaccine）

埃博拉病毒是單股負鏈RNA病毒，屬絲狀病毒，致死率極高。致病機制尚不清楚，曾試用過滅活疫苗，效果不好，減毒疫苗存在危險性，至今尚未成功。

第四節(jié)我國基因工程病毒疫苗的開發(fā)戰(zhàn)略研究（Developmentstrategyofgeneengineeringvaccineinchina)一、首先要明確基因工程病毒疫苗在整個病毒疫苗研究開發(fā)中的地位和任務(wù)(Statusandtask)1主要常規(guī)技術(shù)不能或很難解決的新疫苗(Newgenerationvaccine)

①不能或難于培養(yǎng)的病原體；②有潛在致癌性或免疫病理作用的病原體。2、傳統(tǒng)疫苗的改造（(Reconstructionoftraditionalvaccine）主要針對免疫效果差，負反應大，成本較高和使用不方便的傳統(tǒng)疫苗進行改造（如流感、乙腦等）。3、加強治療性疫苗研究

（Intensificationofcurevaccineresearch)近年來，使用疫苗進行疾病治療的研究發(fā)展迅速，對引起慢性或持續(xù)性感染或與誘發(fā)腫瘤十分相關(guān)的病毒病，治療性疫苗的研究將具有重要性。4、發(fā)展多價疫苗

多價疫苗成本低，免疫程序簡單，是疫苗研究的發(fā)展方向。其發(fā)展方向為：

①使用基因工程技術(shù)對傳統(tǒng)疫苗進行改造，獲得聯(lián)合疫苗；②發(fā)展具有高導入、高表達、強免疫、可加強的新型載體。二、目標的選擇要以社會和市場需求為導向

1、研制預防我國嚴重病毒病的疫苗放在重點位置2、大力發(fā)展有市場前景新型疫苗

三、加強新型疫苗的基礎(chǔ)研究

1、加強疾病免疫保護機制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanism）(1)選取病原體的某些抗原或某些抗原表位，或刪除某些無用甚至有害的組分而構(gòu)成的，因而必須了解這些抗原、表位或組分在病原體致病和免疫中的作用和機體對它們的應答。(2)一些發(fā)病和免疫機制比較簡單的疾病已用常規(guī)疫苗解決了，留下的是一些比較復雜和較難解決的疾病或問題，例如呼吸道、腸道和生殖系統(tǒng)黏膜感染，其病原體常多型善變；易于產(chǎn)生持續(xù)感染基因整合的病毒；免疫病理機制不清的病毒；病原體結(jié)構(gòu)復雜，發(fā)育階段多，免疫保護作用不強；常規(guī)疫苗由于反應大，效果差或引起個別嚴重并發(fā)癥，需用新型疫苗來代替。

2、加強新型疫苗的免疫保護機制的研究（Intensifytheresearchofimmunityprotectionmechanismofnovelvaccine）新型疫苗抗原的免疫保護效果