PCR引物設(shè)計(jì)要點(diǎn)

PCR1.書寫規(guī)章設(shè)計(jì)引物時(shí)，5’3’端引物則與5’3’端〔5’端引物不變，3’端引物與目的序列互補(bǔ)并相反〕；2.引物長(zhǎng)度18~30〔5’端添加的修飾〕，引物太長(zhǎng)和太短都不好；3.GC一般引物序列中G+C40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，3’3G或C。假設(shè)是引物存在嚴(yán)峻的GCAT5’端加適量的A、T或G、CGC4.退火溫度可以用軟件PrimePrimer20bp以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5TmTm55~65℃之間較好，假設(shè)待擴(kuò)增基因的GC〔50%〕，引物的65℃，由于提高退火溫度可以降低非特異性擴(kuò)增。一對(duì)引物的退火溫度應(yīng)盡量接近，相差范圍應(yīng)在5℃之內(nèi)；一般初次PCR5℃，假設(shè)擴(kuò)不5℃5℃1℃1℃1℃1℃降，由于這樣效果不大；5.避開與靶DNA引物要具有特異性，與非特異擴(kuò)增序列的同源性不應(yīng)超過(guò)70%或有連8BLAST特異挨次上；6.避開引物及模版的二級(jí)構(gòu)造區(qū)域47-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP。假設(shè)有可能，也應(yīng)盡量避開擴(kuò)增含穩(wěn)定二級(jí)構(gòu)造的目的片段(可用軟件估量，一般待擴(kuò)區(qū)域自由能△G58.6lkJ/mol7.避開引物二聚體43’端的互補(bǔ)重疊；83’端1)3’3G或C，以免使引物在G+C錯(cuò)誤引發(fā)；2)除在特別的PCR〔AS-PCR〕3’端不能發(fā)生錯(cuò)配；3’33易發(fā)生簡(jiǎn)并，會(huì)影響擴(kuò)增特異性與效率；3’端使用堿基A，以免增加使用Taq率；5〕假設(shè)片斷連入表達(dá)載體或轉(zhuǎn)基因載體，基因后面帶有其它tag，如Hitag,或Fattag,GFP,GUStopcodon，否則tagtag掉基因的tartcodon，由于此時(shí)基因跟在tagtagtartcodon。留意無(wú)論是前面融合還是后面融合tag，千萬(wàn)要反復(fù)校對(duì)所設(shè)計(jì)的引物，務(wù)必使擴(kuò)出的挨次酶切連入終載體后前后挨次的讀碼框正確，否則翻譯出來(lái)的蛋白可能完全錯(cuò)誤。9.5’端1)5’端可進(jìn)展修飾，包括：引入酶切位點(diǎn)、蛋白質(zhì)結(jié)合DNA列、突變位點(diǎn)、插入與缺失突變序列和啟動(dòng)子序列，標(biāo)記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；25’端修飾可能引起讀碼框移位，可在修飾寡核12101)引入酶切位點(diǎn)假設(shè)PCR5’2～3基數(shù)目不同，可查閱NEB的catalogueLabprotocolfolder；假設(shè)PCRPCR-Blunt或T-vector5’端無(wú)需加保護(hù)堿基；2)特別的粘性末端LICTAIn-Fuion往要求插入片段帶有特定粘性末端，設(shè)計(jì)時(shí)須留意；