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文檔簡介

PCR1.書寫規(guī)章設計引物時，5’3’端引物則與5’3’端〔5’端引物不變，3’端引物與目的序列互補并相反〕；2.引物長度18~30〔5’端添加的修飾〕，引物太長和太短都不好；3.GC一般引物序列中G+C40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，3’3G或C。假設是引物存在嚴峻的GCAT5’端加適量的A、T或G、CGC4.退火溫度可以用軟件PrimePrimer20bp以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5TmTm55~65℃之間較好，假設待擴增基因的GC〔50%〕，引物的65℃，由于提高退火溫度可以降低非特異性擴增。一對引物的退火溫度應盡量接近，相差范圍應在5℃之內；一般初次PCR5℃，假設擴不5℃5℃1℃1℃1℃1℃降，由于這樣效果不大；5.避開與靶DNA引物要具有特異性，與非特異擴增序列的同源性不應超過70%或有連8BLAST特異挨次上；6.避開引物及模版的二級構造區(qū)域47-deaza-2’-脫氧GTP取代dGTP。假設有可能，也應盡量避開擴增含穩(wěn)定二級構造的目的片段(可用軟件估量，一般待擴區(qū)域自由能△G58.6lkJ/mol7.避開引物二聚體43’端的互補重疊；83’端1)3’3G或C，以免使引物在G+C錯誤引發(fā)；2)除在特別的PCR〔AS-PCR〕3’端不能發(fā)生錯配；3’33易發(fā)生簡并，會影響擴增特異性與效率；3’端使用堿基A，以免增加使用Taq率；5〕假設片斷連入表達載體或轉基因載體，基因后面帶有其它tag，如Hitag,或Fattag,GFP,GUStopcodon，否則tagtag掉基因的tartcodon，由于此時基因跟在tagtagtartcodon。留意無論是前面融合還是后面融合tag，千萬要反復校對所設計的引物，務必使擴出的挨次酶切連入終載體后前后挨次的讀碼框正確，否則翻譯出來的蛋白可能完全錯誤。9.5’端1)5’端可進展修飾，包括：引入酶切位點、蛋白質結合DNA列、突變位點、插入與缺失突變序列和啟動子序列，標記生物素、熒光、地高辛、Eu3+等；25’端修飾可能引起讀碼框移位，可在修飾寡核12101)引入酶切位點假設PCR5’2～3基數(shù)目不同，可查閱NEB的catalogueLabprotocolfolder；假設PCRPCR-Blunt或T-vector5’端無需加保護堿基；2)特別的粘性末端LICTAIn-Fuion往要求插入片段帶有特定粘性末端，設計時須留意；

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