2020年生物安全管理體系文件

生物安全管理體系文件

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實驗室生物安全管理制度

目的：確保實驗人員生物安全，環(huán)境不受污染，樣品質量不受影響特制定

該管理制度。

一、人員準入條件

1、實驗室人員、輔助人員和外來人員必須具備相應的專業(yè)技能、受過相關的

實驗室生物安全培訓、了解實驗室潛在的生物危害和特殊要求，經(jīng)負責人審批

后方可進入相應的實驗室工作。

2、未成年人、孕婦和有免疫缺陷的人員不得進入實驗室，處于易受感染狀態(tài)

或感染后果嚴重的額人員也不得進入實驗室。

3、實驗室人員必須在身體狀況良好、穿戴好防護服（白大衣）的情況下，方

能進入實驗室的污染區(qū)域工作。但當身體出現(xiàn)較大的開放性損傷、處于較重的

疾病感染狀態(tài)或呈重度疲勞狀態(tài)時不得進入。

4、外來參觀人員需經(jīng)科室負責人同意并在相關人員陪同下方可進入實驗室。

二、生物安全日常管理：

（一）生物安全行為規(guī)范

1.進入實驗室前要摘除首飾，修剪指甲，以免刺破手套。長發(fā)應束在腦后，

禁止在實驗室內(nèi)穿露腳趾的鞋。不得佩戴有可能被卷入機器或可隨人傳染性物

質的飾物。

2.在實驗室里工作時，要始終穿著實驗服，實驗室外禁止穿防護服（白大

衣）。大白衣應定期清洗、更換，清洗時應使用具有殺菌消毒的洗液或其它相

應方法。

3、操作感染性物質、腐蝕性或毒性物質時須在通風櫥中進行，并佩戴相關的

安全防護用品，如安全鏡、面罩或護目鏡。皮膚受損時應以防水敷料覆蓋。

4、當有必要保護眼睛和面部以防實驗對象噴濺、或紫外線輻射時，必須要配

戴護目鏡，面罩（帶護目鏡的面罩）或其它防護用品。

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5、實驗室工作區(qū)不允許吃、喝、化妝和操作隱形眼鏡，禁止在實驗室工作區(qū)

內(nèi)的任何地方貯存人用食品及飲料。

6、實驗室防護服不應和日常服飾放在同一柜子。個人物品、服裝和化妝品不

應放在有規(guī)定禁放的和可能發(fā)生污染的區(qū)域。

7、不得涉及呼吸道傳播疾病樣品室，要佩戴符合要求的防護口罩。

（二）操作準則

1、所有樣本、培養(yǎng)物均可能有傳染性，操作時均應帶手套。在認為手套已被

污染時應脫掉手套，馬上洗凈雙手，再換一雙新手套。

2、當實驗過程可能涉及到直接或意外接觸到血液、有傳染性的材料或被感染

的動物時，必須要戴上合適的手套，脫手套后必須洗手。在實際或可能接觸了

血液、體液或其它污染材料后，即使戴有手套也應立即洗手。

3、不得用戴手套的手觸摸自己的眼、鼻子或其它暴露的黏膜或皮膚。不得帶

手套離開實驗室或在實驗室來回走動。

4、嚴格禁止用嘴操作實驗器材，包括吸液、吹酒精燈等。實驗材料禁止放入

嘴里。禁止舔標簽。

5、盡量用塑料制品代替玻璃制品，不使用破裂或有缺口的玻璃器具。破損的

玻璃不能直接用手直接操作，必須用機械方法清除，如刷子、夾子、鏡子等。

破裂的玻璃器具和比例碎片應丟棄在有專門標記的、單獨的，不易刺破的容器

里。

6、所有的實驗步驟都應盡可能使氣溶膠或氣霧的形成控制在最小程度。任何

使形成氣溶膠的危險性上升的操作都必須在生物安全柜里進行。有害氣溶膠不

得直接排放。

7、應盡可能減少使用利器和盡量使用替代品。包括針頭、玻璃、一次性手術

刀在內(nèi)的利器，應在使用后立即放在耐扎容器中。尖利物容器應在內(nèi)容物達到

三分之二前置換。

8、所有濺出事件、意外事故和明顯或潛在的暴露于感染性材料，都必須向實

驗室負責人報告。此類事故的書面材料應存檔。

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9、所有棄置的實驗室生物樣本、培養(yǎng)物和被污染的廢棄物應被假定有傳染

性，在從實驗室中取走之前，應以安全方式處理和處理，使其達到生物學安

全。

10、實驗室應保持整潔、干凈，當潛在的危險物濺出或一天的工作結束后，所

有操作臺面、離心機、加樣槍、試管架必須擦拭、消毒。

11、每日工作完畢，最后一個離開實驗室的人員需關好水、電、門、窗。

（三）監(jiān)督與檢查

1、涉及病原體的科室負責人要經(jīng)常對各項實驗的生物安全性進行檢查和監(jiān)

督。

2、各實驗項目主管人員要定期對所開展的實驗工作進行監(jiān)督與檢查，及時發(fā)

現(xiàn)并報告安全隱患事件。

三、常見實驗室廢棄品處理

實驗室廢棄品按物理類型而言可分為固體廢棄品、液體廢棄品及氣體

廢棄品，就危害類型而驗分為化學毒性廢品和病原性廢品，由于廢棄物品具有

潛在的致病性、傷害性，如不妥善處理會造成很大的人身危害、環(huán)境污染和社

會危害。根據(jù)《國家危險廢物品名錄》、《醫(yī)療廢物管理條例》、衛(wèi)生部和國

家環(huán)境保護總局制定的《醫(yī)療廢物分類目錄》有關規(guī)定的要求，對實驗室廢棄

物進行分類，主要包括感染性廢棄物、病理性廢棄物、損傷性廢棄物、化學性

和放射性廢棄物等。

分類特征常見廢棄物名稱處理程序

感染攜帶病包括被感染性放入盛有適宜

性廢原微生實驗材料等污消毒液的不易

棄物物具有染的物品與器碎裂的容器中

引發(fā)感材，如手套、浸泡。注意消

染性疾口罩與白大毒劑的種類、

病傳播衣、試管、平濃度及浸泡時

危險的皿、吸管等實間，浸泡后放

廢棄物驗器材以及廢入合適的容器

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棄的感染性實內(nèi)進行身壓火

驗標本、培養(yǎng)菌或焚燒處理

液、培養(yǎng)基

等。

病理實驗動包括廢棄的質集中與實驗室

性廢物尸體粒、細胞、單指定位置，嚴

棄物等廢棄克隆課題、臨格與感染性生

物床、組織樣本物材料區(qū)分，

及實驗動物組高壓火菌后廢

織、尸體等。棄。盛放容器

宜浸泡消毒。

損傷能刺傷包括醫(yī)用枕局壓滅菌或焚

性廢或割傷頭、縫合針、燒處理，盛放

棄物人體的手術刀及破碎銳器的一次性

銳器等玻璃等容器不易刺

廢棄物破，不宜將容

器裝得過滿

（小于四分之

三）,如感染

性廢棄物進行

高壓火菌及焚

燒處理

化學具毒包括強酸、強強酸強堿等化

性、性、腐堿等有毒有害學性物品須經(jīng)

放射蝕性、的化學性廢棄中和消除腐蝕

易燃易行后方可廢

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性廢爆的化物一級放射性棄，其它物品

棄物學性廢廢棄物等。經(jīng)稀釋對環(huán)境

棄物及與人體無毒后

放射性可廢棄。含有

廢棄物毒、有害化學

物品的實驗材

料在使用后應

置于帶明顯危

險標志的容器

內(nèi)送至指定地

點統(tǒng)一處理。

四、支持文件

1.《中華人民共和國傳染病防治法》

2.《病原微生物實驗室生物安全管理條例》

3.《實驗室生物安全通用要求》（改變9489-）

4.《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》（WS233-）

5.《實驗室生物安全守則》（WHO,第三版，）

6.《病原微生物實驗室生物安全》（生物安全培訓衛(wèi)生部規(guī)劃教材，第2版）

7.《醫(yī)療廢棄物管理條例》

8.《實驗室生物安全》

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病毒制備質量管理體系

目錄

原始病毒的擴增

大量病毒制備的滅菌操作

病毒制備程序

痘苗病毒的收獲和純化

腺病毒的收獲和純化

病毒滴度測定

病毒質控

細菌污染及檢測

支原體污染及檢測

基因檢測

病毒活性檢測

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體外細胞殺傷復制能力檢測

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原始病毒的擴增

病毒種子制備

一般原始病毒的擴增用優(yōu)質（無污染-須經(jīng)過細菌和支原體檢測）CV1/

JH293細胞，

每種原始病毒的擴增需要在一個細胞融合度工80%（細胞處于對數(shù)生長期，

活性好，感染效率高）的T175培養(yǎng)瓶中進行：

1.細胞計數(shù)：

①培養(yǎng)箱中取出細胞，鏡下觀察，將狀態(tài)良好，融合度叁80%的細胞移至

超凈工作臺。

②去除細胞培養(yǎng)瓶中的舊培養(yǎng)基。

③PBS沖洗：從無細胞一側加入適量（約10mDPBS沖洗細胞后棄上清，

酌情重復廣2次，以達到徹底洗掉培養(yǎng)基中的血清成份。

④消化細胞：加入1ml0.25%胰酶消化液，使之鋪滿細胞表面，放入培養(yǎng)

箱（37℃）作用數(shù)分鐘后，把培養(yǎng)瓶放置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細胞回縮變圓，細

胞間隙增大；或肉眼觀察，見到瓶底出現(xiàn)細針孔間隙傾斜瓶子出現(xiàn)流沙樣現(xiàn)象即

可終止消化。

⑤終止消化：輕拍培養(yǎng)瓶使細胞自瓶壁脫落，從無細胞面?zhèn)燃尤脒m量完全

培養(yǎng)基（含血清的DMEM）終止消化，并用移液管吸吹數(shù)次以打散細胞團塊，混

合均勻，使之成為單細胞混合液。

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⑥計數(shù)板準備：用酒精清潔計數(shù)板及專用蓋玻片，然后用綢布輕輕拭干。

⑦加樣：用移液管輕輕吹打細胞懸液，取少許細胞懸液（可酌情稀釋），在

計數(shù)板上蓋玻片一側靠虹吸現(xiàn)象加入微量（約10ul）細胞懸液，使之充滿玻璃

槽，不可產(chǎn)生氣泡，不可溢出外側亦不可溢入對側玻璃槽。如產(chǎn)生上述情況需對

計數(shù)板沖洗拭干重新加樣。

⑧計數(shù)：靜置片刻，使細胞沉降到計數(shù)板上，不再隨液體漂移，將細胞計

數(shù)板放置于顯微鏡的載物臺上夾穩(wěn)，先在低倍鏡下找到計數(shù)區(qū)后，再轉換高倍鏡

觀察并計數(shù)。由于活細胞的遮光率和液體的折光率相近，觀察時應減弱光照的強

度。

⑨計數(shù)時計數(shù)區(qū)是由16個中方格組成，按

對角線方位，數(shù)左上、左下、右上、右下的4

個大方格的細胞數(shù)，為了保證計數(shù)的準確性，

避免重復計數(shù)和漏記，在計數(shù)時，對沉降在格

線上的細胞的統(tǒng)計應有統(tǒng)一的規(guī)定計數(shù)原則：

計上不計下，計左不計右！如細胞位于大方格

的雙線上，計數(shù)時則數(shù)上線不數(shù)下線，數(shù)左線

不數(shù)右線，以減少誤差。即位于本格上線和左

線上的細胞計入本格，本格的下線和右線上的

細胞按規(guī)定計入相應的格中。

按下式計算：

細胞懸液細胞數(shù)/ml=4個大格細胞總數(shù)

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/4xl0000x稀釋倍數(shù)

2.感染種子：取平行對照培養(yǎng)優(yōu)質融合度叁80%的細胞，棄舊培養(yǎng)基并

加入含病毒種子的30mL感染培養(yǎng)基(DMEM+10%FBS+lpfu/cell),輕輕晃動培

養(yǎng)瓶，使病毒在培養(yǎng)基中充分混勻。

3.收集種子：標記病毒種類和培養(yǎng)日期，在37℃,5%CO2條件下培養(yǎng)。

定時(24h/48h/60h/72h)檢查CPE(細胞變圓變亮脫壁，漂浮)，待叁80%細胞出

現(xiàn)CPE,即可收集。將含病毒細胞懸液加入50mL離心管中，標記病毒種類和日

期，凍存于-80℃?zhèn)溆?，并測定病毒滴度，以備感染病毒使用。

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大量病毒制備的滅菌準備工作

1.用過的500mL離心瓶泡入酸液中，過夜，沖洗干凈，烤干，高溫滅

菌。

2.準備足量T175培養(yǎng)瓶必須泡入酸液中，過夜,用水充分沖洗,干燥，

滅菌包布包被滅菌。

3.培養(yǎng)細胞所用的移液管，離心管必須泡入酸液中，過夜，用沖洗干

凈，干燥，滅菌包布包被滅菌。

4.離心管泡入酸液中，過夜后再處理，針頭直接滅菌，在移除針頭錢，

確保離心管實在一個大燒杯上，這樣漏液不會污染操作臺。

5.研磨器泡入酸液中，過夜，用水充分沖洗，干燥，滅菌包布包被滅

菌。

6.Beckman超高速離心機及特制轉子和離心管準備。

7.V型槽，96孔板，排槍準備。

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病毒制備程序

一.細胞準備:

1.建立細胞種子庫：復蘇細胞（CV1用于痘苗病毒病毒；JH293用于腺病毒

病毒）分別于與第3/5/7/14天取上清兩份，一份用于支原體檢測，另一份加至

培養(yǎng)基中放于培養(yǎng)箱中定時鏡下觀測，用于細菌檢測，保證細胞質量。待細胞生

長細胞融合度叁80%消化傳代擴增并凍存足量細胞種子于液氮中，凍存管上須準

確標記所凍細胞名字，代數(shù)，凍存人以及凍存日期等相關信息。（慢凍速溶）

2.細胞擴增培養(yǎng)：

①當1瓶T175培養(yǎng)瓶中細胞生長融合度叁80%時，將培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸

出，各加入1ml胰酶消化，37℃,2-3分鐘；加入適量（5ml）完全培養(yǎng)基終止

消化，全部轉移至50ML離心管中，總量為6ml。分別抽取2ml此混合液加入含

18ml完全培養(yǎng)基（含10%血清）的T175培養(yǎng)瓶中共三瓶繼續(xù)培養(yǎng)（1傳3）,原

瓶繼續(xù)培養(yǎng)待下一次傳代。

②繼而同上方法擴增至12瓶T175培養(yǎng)瓶培養(yǎng)（1傳4）細胞生長融合度

叁80%時同上方法擴增至36瓶為一批（1傳3）,其中1瓶T175培養(yǎng)瓶中細胞作

為平行對照，放入37CCO2孵育箱中培養(yǎng)48-72小時。平行對照培養(yǎng)瓶同時放

入孵育箱，直至融合度叁80%。

二.病毒感染:

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①觀察平行對照培養(yǎng)瓶中細胞生長率工80%時，準備進行病毒感染；同時也

觀察其它所有細胞，對比細胞增殖速度是否一致。

②取平行對照瓶細胞計數(shù)，并計算需要感染病毒量(Ipfu/cell)。

③-80℃冰箱中取出測定過病毒滴度的病毒種子，按計算好的病毒量配制

1080ml(30ml/瓶x36瓶)含2%血清的DMEM培養(yǎng)基。放入37c二氧化碳孵育箱

中培養(yǎng)48-72小時，或直到290%細胞都出現(xiàn)CPE。

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痘苗病毒的收獲和純化

三.病毒收獲：

1）從37℃二氧化碳孵育箱中取出達到收獲標準的36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃

動培養(yǎng)瓶，少量貼壁細胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打

未脫落細胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。

2）移至高速離心機中配平，3500rpm,15min,4℃離心。

3）棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉入50ml離

心管中。

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4）方法同上，用冷PBS重復清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉致同一50ml

離心管中。

5）移至高速離心機中配平，3500rpm,15min,4℃離心。

6）棄上清，4c取7ml冷W-Buffer重懸混勻，并凍存于-80℃待純化。

四.病毒純化：

1）將待純化病毒溶液在液氮與37c水浴鍋中重復凍融三次，使包含于細胞內(nèi)

的病毒顆粒完全釋放。

2）將完全融化的病毒液移至超凈工作臺，加入滅菌的研磨器中勻速緩慢重復研

磨60次。

3）將研磨好的病毒液轉入50ml離心管中配平，1200rpm,5min,4℃離心。

4）吸取上清于另一50ml離心管中，取3mlW-Buffer重懸沉淀，2mlW-

Buffer沖洗離心管，加至同一50nli離心管，將混合液再次加入研磨器中重

復研磨60次。

5）將研磨好的病毒液轉入50ml離心管中配平，1200rpm,5min,4℃離心。

6）取上清于一新的無菌離心管中，移至超聲儀中超聲（破碎）兩次，每次20s0

7）在SW41Beckman離心機專用離心管中加入7ml36%蔗糖（w/v）K10MMTris-

Hcl（PH9.0）配制加再沿管壁緩慢加入3.5ml研磨超聲處理過的病毒液,

使之形成分層。

8）用VV-Buffer稱重配平，誤差須小于0.5g（誤差越小越好），移至Beckman

離心機中（i~4/2~5/3~6轉子對應配平）13500rpm/32900xg,

80min,4℃o

9）待離心結束，將轉子移至超靜工作臺打開，用鏡子小心拿掉轉子蓋子，切勿

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污染，再用無菌鏡小心取出離心管，去除上清，取6mlW-Buffer重懸沉淀。

10）梯度蔗糖：

底層為4ml40%蔗糖溶液（用lOmMTris-HCLpH9.0配制），依次向上分別

為4ml35%蔗糖溶液；4ml30%蔗糖溶液和4ml25%蔗糖溶液（最上層）。每

個病毒樣本制備至少兩份梯度，分別小心在上層加入病毒懸液，使之形成分層。

11）用10n）MTris-Hcl（PH9.0）稱重配平，誤差須小于0.5g（誤差越小越好），

移至Beckman離心機中（1~4/2~5/3~6轉子對應配平）OrpiH,60min,

4℃o

12）待離心結束，將轉子移至超靜工作臺打開，用鐐子小心拿掉轉子蓋子，切勿

污染，再用無菌鑲小心取出離心管，去除上清，取2mlW-Buffer重懸沉淀。

13）病毒分裝與儲存：取滅菌EP管，取少量病毒液進行滴度測定，其余根據(jù)實

驗需要按20ul/50ul/lOOul/支并按規(guī)定明確標記病毒名稱，日期等信

息后，冰上分裝凍存于-80℃冰箱病毒庫。

腺病毒的收獲和純化

三.病毒收獲：

7）從37C二氧化碳孵育箱中取出達到收獲標準的36瓶T175培養(yǎng)瓶，輕輕晃

動培養(yǎng)瓶，少量貼壁細胞即刻脫落。而后移至超凈工作臺用移液管輕輕吹打

未脫落細胞，并將含病毒混合液分裝（收集）到滅菌的500ml離心瓶中。

8）移至高速離心機中，rpm,10min,4c離心。

9）棄上清，移液管取10ml冷PBS加至離心瓶中重懸混勻，將液體轉入50ml離

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心管中。

10）方法同上，分別用冷PBS5ml重復清洗兩次500ml離心瓶，并將液體轉致同

一150ml離心管中。

11）移至高速離心機中配平，lOOOrpm,lOmin,4c離心。

12）棄上清，4C取12ml冷的10mMTris.HCI（Ph8.0）重懸混勻，并凍存于-80℃

待純化。

四.病毒純化：

1.將制備的含病毒溶液在液氮和37C水浴中重復凍融三次。

2.將該溶液37℃水浴融化，轉入50ml離心管中，室溫，6000rpm離心10

分鐘。保留上清，凍存于-80℃冰箱或立即進行CsCI梯度離心。

3.將6只超高速離心用離心管中分別先加入10ml1.25g/mlCsCI.再小心輕輕

加入7.6ml1.4g/mlCsCL,然后將病毒混合液平均輕輕加入CsCI液面上。

4.稱重，用滅菌的Tris.HCI（Ph8.0）配平，誤差V0.1g。

5.將離心管放入BeckmanSW32轉子中，放入LE-80K超速離心機中（「4/

2~5/3~6轉子對應配平）離心,25000rpm,15℃,2小時。

6.小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用19號針頭

刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物（病毒條帶呈乳白色），盡量多抽，將

所抽出液體轉入50ml離心管中。

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7.將50ml離心管中含病毒液體順液面輕輕平均分配加入至已加入

3ML1.35g/mlCsCI溶液的5ml超高速離心用離心管中。

8.用Tris.HCI(Ph8.0)稱重配平，誤差VO.1g。

9.將離心管放入BeckmanSW41轉子中，放入LE-80K超速離心機中(1~4/

2~5/3~6轉子對應配平)離心，40000rpm,15℃,15小時。

10.小心取出離心管放于無菌操作臺中，將離心管夾于管夾上，用19號針頭

刺入離心管，小心抽取夾層膜狀物(病毒條帶)，盡量少抽，將所抽出液體

轉入50ml離心管中。

11.將液體注入透析袋中，放入透析液中，于冷室中透析24小時。

12.病毒分裝與儲存：透析結束后，將透析袋轉至無菌工作臺中，取少量病

毒液進行滴度測定，其余病毒液根據(jù)實驗需要按20ul/50ul/100ul/

支并按規(guī)定明確標記病毒名稱，日期等信息后，冰上分裝儲存于-80℃冰

箱病毒庫。

病毒滴度測定(TCID50)

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1.培養(yǎng)CV-1(W)或JH293(AD)細胞。

2.當培養(yǎng)瓶中細胞生長率叁80%時，將各培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)基吸出，各加入少量

胰酶消化，37C,2-3分鐘；再各加入5mLi0%FBS的DMEM培養(yǎng)基混勻，細胞計

數(shù)。

3.根據(jù)細胞計數(shù)結果將細胞鋪入96孔板，每孔3x103細胞于200微升10%

FBS的DMEM,過夜。

4.第二天早晨，按比例稀釋病毒，一般是1：IO'稀釋：

10ul病990111

9QQ7n1

20nl桂格加至

第一排用排槍加入20微升，輕輕混勻5次，去掉槍頭；

從第一排吸取22微升加入到的第二排，輕輕混勻5次；

同樣從第二排吸取22微升加入到第三排，輕輕混勻5次;

依次到倒數(shù)第二排，最后一排做對照。

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5.從感染病毒起，第8To天觀察。先觀察最后一排細胞狀態(tài)，長滿時,

計每排CPE的數(shù)值。計算病毒滴度。

6.代入以下表格計算病毒滴度:

DilutionsNo.infectedNo.un-Totalno.Totalno.un-%totalAbove0.5%above0.5%below0.5logdilu

wellsinfectedinfectedinfectedinfectedabove5

wells

1.00E-051206901TRUE000

1.00E-061205701TRUE000

1.00E-071204501TRUE000

1.00E-081113310.9705882TRUE000

1.00E-091022230.88TRUE000

1.00E-105712100.5454545TRUE0.54545450-10

1.00E-11757150.3181818FALSE00.31818180

#ofWells12

mls/well0.020.50.54545450.3181818-10

Prop.Dist.0.2

Log-10.2

TCID50

TCID506.3096E-11

1/TCID501.5849E+10

TCID50/ml7.9245E+11

pfu/ml5.4679E+11

cell

number90000

\4Dlume2

pfu/cell12150848

病毒質控

細菌污染及檢測;

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二、支原體污染及檢測；

三、基因檢測；

四、病毒活性檢測；

五、體外細胞殺傷復制能力檢測。

資料僅供參考

、細菌污染及檢測:

1.1背景介紹：

細菌是一種元和細胞微生物，其大小以微米計。

常見的污染細菌有革蘭氏陰性菌和假單胞菌等，革蘭氏陰性菌中白色葡萄菌

等比較常見。純化后的病毒有細菌污染時并不容易發(fā)現(xiàn)。因此，做病毒的細菌

質控非常必要。

1.2實驗步驟:

資料僅供參考

當做細菌檢測時，能夠取10ul已經(jīng)純化好的病毒加入無抗生素4nli的培養(yǎng)

基(當前實驗室所用的是LB培養(yǎng)基)試管中，將試管置于37C,1800rpm的

搖床上搖過夜(12-16h)，如果有細菌污染，16h內(nèi)就可獲得陽性結果。

1.3結果判讀：

多數(shù)情況下當受到細菌污染時，培養(yǎng)基短時間內(nèi)顏色變黃，產(chǎn)生大量酸性物

質，出現(xiàn)明顯混濁現(xiàn)象，此時的培養(yǎng)基稍加振蕩就會有混濁物懸起。在倒置顯

微鏡下觀察，可見培養(yǎng)基有大量圓球狀顆粒漂浮，此種情況即可判定為陽性，

病毒受到細菌污染。若無，則判讀為陰性。

二、支原體污染及檢測:

2.1背景介紹:

資料僅供參考

支原體是一種介于細胞和病毒之間、能獨立生活的最小微生物，最小的直徑

0.2um,約有1%可經(jīng)過濾菌器，無細胞壁，形態(tài)呈多形性，可為圓形、絲狀或梨

形。在光鏡下不易看清內(nèi)部結構。電鏡下觀察支原體膜為三層結構，其中央有

電子密度大的密集顆粒群或絲狀的中心束。

支原體的污染是一個常見又棘手的問題。支原體污染后，因它可與病毒長期

共存，培養(yǎng)基一般不發(fā)生混濁，外觀上往往給人以“正?！钡母杏X，實則可能

對后期實驗產(chǎn)生潛在影響，因此對支原體的污染必須嚴加防范。

支原體污染常見檢測方法有相差顯微鏡法、DNA熒光處理法、電鏡檢測法、

低張?zhí)幚淼匾录t染色觀察、支原體PCR檢測法等。實驗室當前使用的是PCR檢

測法。

2.2實驗步驟：

（1）實驗前準備：

①樣本和對照準備：

樣本：收集待檢測病毒樣本，若為病毒原液則可用5ul原液加495ul細胞

培養(yǎng)基（確定無污染）進行100倍稀釋。

陽性對照：從醫(yī)院取得支原體陽性樣本，高壓滅菌后（可分裝50ul一

支）做陽性對照。

陰性對照：滅菌蒸儲水。

②引物的準備：

Fwd-1.：ACTCCTACGGGAGGCAGCAGTA

Fwd-2.：CCTAAAGGAATTGACGGGAACCCG

Rev.：TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC

以上引物能夠檢測出常見的14種不同支原體。

按要求稀釋為50pmol/uL分裝為50ul/管，-20℃保存，待使用。

(2)PCR反應:

資料僅供參考

配置全過程需在冰上操作:

①1stRound-bandat720bp按下列組分配置PCR反應液:

滅菌蒸儲水upto20ul

10*PCRBuffer2ul

Dntp(2.5mM)1.6ul

MgC12(25mM)1.2ul

MT

Fwd-1.lul

Rev.lul

Taq酶0.3ul

樣本/對照lul

1st反應條件

95℃x30s

95℃x30s

56℃x30s35cycles

72℃x1min

72℃x1min

反應大約需1.5小時，由此得到第一輪相應的PCR產(chǎn)物，在打開PCR

管前先離心甩一下，接著進行第二輪145bp的PCR鑒定。

②2ndRound-Bandat145bp按下列組分配置PCR

反應液：

滅菌蒸館水upto20ul

10*PCRBuffer2ul

Dntp(2.5mM)1.6ul

MgC12(25mM)1.2ul

MT

Fwd-2.lul

Rev.lul

Taq酶0.3ul-

資料僅供參考

第一輪PCR的產(chǎn)

物（對應樣本/對

照）lul

加過模板，第一輪產(chǎn)物可加1ul10*lodingbuffer，混勻后先放置4c冰

箱。

待跑瓊脂電泳膠。

U

nd

2反應條件（與第一輪相同）

95℃x30s

95℃x30s-

56℃x30s一35cycles

72℃x1min_

720cxlmin

第二輪產(chǎn)物加1ul10*lodingbuffer,終止反應，跑瓊脂

電泳膠。

（3）瓊脂電泳跑膠：

①配置1%的瓊脂糖凝膠即可。

首先將錐形瓶洗干凈，然后根據(jù)樣本量和膠的大小取一定量的電泳緩沖

液（1XTAE）至錐形瓶中，再稱取相應量的AGAROSE（瓊脂糖）倒入錐形瓶

中，搖勻，最后放入微波爐加熱，煮膠的過程中需注意安全，應適當搖勻，防

止爆沸。煮好的凝膠需無氣泡、色澤及質地均勻。

資料僅供參考

將煮好的凝膠放入均勻冷卻至50℃左右時，加入相應EB,混勻，及時將

凝膠倒入裝好的干凈模具中。

待凝膠完全凝固（約30min）后，垂直方向拔梳子。此時，凝膠需平

整、不漏孔，能夠用于電泳檢測。

②膠前準備：

先將干凈的電泳槽排放整齊并做好標記，然后把凝膠連同膠托一起放入電

泳槽正中央。

膠孔的方向朝向負極（注意：①放凝膠前，需將膠托底部的凝膠抹干凈，

防止膠托在電泳槽中滑動；②此時，可順便觀察凝膠是否漏孔）。

再往電泳槽中倒入一定量的電泳緩沖液（1XTAE）至剛好將凝膠淹沒。

（注意保持桌面衛(wèi)生，防止緩沖液灑到桌。

③上樣：

將兩輪的產(chǎn)物和lodingbuffe混合后，輕甩，按照規(guī)定的順序上樣，上

樣順序應與電泳槽上的標記一致。

注意：

上樣時必須確保上樣順序正確無誤，樣品間不混淆，點樣后的空管子先

放在電泳槽旁邊，用于核查；

點樣時不戳孔、不外漏、不溢出；

點樣時需小心槍頭不要碰到凝膠，以免凝膠挪動，若凝膠已經(jīng)挪動，需

等樣品完全沉到底部后，再固定凝膠.

樣品上完后，加陽性對照，陰性對照。

每排膠上留一孔加Maker（Dbp）,5ul.

④跑電泳:

資料僅供參考

確認已經(jīng)正確上樣后，雙手同時蓋上電泳槽蓋，接通電泳儀和電泳槽

（注意：確認電極正確連接），設置電泳參數(shù)：電壓：100V,電流：400mA,

時間：25min；注意確認電極、電泳參數(shù)完全正確之后，最后按star鍵開始

電泳。

⑤凝膠成像：

帶上PE手套，將凝膠從染膠盤中撈出，放在染膠時的那個PE手套上

（注意：撈膠時需小心防止凝膠斷裂、滑落，盡量把多余的EB染液甩干），將

凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)中，按照“Tanon凝膠成像系統(tǒng)操作規(guī)程”進行操作拍

照。（注意：拍照時需嚴格區(qū)分EB污染區(qū)與非污染區(qū)，防止EB污染區(qū)污染電

腦、鍵盤及鼠標），最后保存膠圖信息至規(guī)定的文件夾內(nèi)，命名規(guī)則為：日期+

姓名+工號+部門+電泳銅人陣考核。

注意事項1、電泳中使用的溟化乙錠（EB）為中度毒性、強致癌性物

質，務必小心，勿沾染于衣物、皮膚、眼睛、口鼻等。

操作時戴上乳膠手套，必要時戴上PE手套和口罩。

三.基因檢測：

試驗1:BioTTTOOl基因組測序試驗

一、目的

檢測BioTTTOOl序列信息

二、試劑來源、配制及保存條件

試劑來源/品牌貨號存儲

BioTTTOOl深圳S160324A-80度

QIAmpDNAbloodminiQIAGEN51104室溫

kit

資料僅供參考

蛋白酶KTIANGEN040204度

三、儀器設備

儀器品牌型號

離心機ThermoIECMICROMAX

微量分光光度計ThermoNANODROPONE

恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2

振蕩器SCIENTIFICVORTEXGENIX2

INDUSTRIES

四、試驗過程

1.病毒基因組提取

1.1向200ulBioTTTOOl原液中加入10ul蛋白酶K,混勻。

1.2加入200ulALBuffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，

孵育10分鐘。

1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱

中。

1.4離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml離心管中。

1.5加入500ulBufferAW1,離心8000轉1分鐘。

1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2,14000轉離心3分鐘。

1.7棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。

1.8向吸附柱中加入50ul趣純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘

2.濃度測定

2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。

2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。

2.3吸取lul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。

3.送華大基因測序

3.1準備總量為2.5ug,濃度不低于80ng/ul的樣品，進行測序。

3.2華大基因進行樣品檢測，并出示檢測報告。

3.3樣品檢測合格后，建立樣品庫進行測序。

3.4數(shù)據(jù)分析。

資料僅供參考

試驗2:BioTTTOOl基因組酶切試驗SOP

資料僅供參考

一、目的

經(jīng)過酶切驗證BioTTTOOl的構建

二、試劑來源、配制及保存條件

試劑來源/品牌貨號存儲

BioTTTOOl深圳S160324A-80度

QIAmpDNAbloodminiQIAGEN51104室溫

kit

蛋白酶KTIANGEN040204度

EcoRVNEBR1095S-20度

Buffer3.1NEBB7203S-20度

瓊脂糖Invitrogen75510-019室溫

DNAMarkerTIANGENlOObp4度

三、儀器設備

儀器品牌型號

離心機ThermoIECMICROMAX

微量分光光度計ThermoNANODROPONE

恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2

振蕩器SCIENTIFICVORTEXGENIX2

INDUSTRIES

瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C

瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500

四、試驗過程

1.病毒基因組提取

1.1向200ulBioTTTOOl原液中加入10ul蛋白酶K,混勻。

1.2加入200ulALBuffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，

孵育10分鐘。

1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱

中。

1.4離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml離心管中。

1.5加入500ulBufferAW1,離心8000轉1分鐘。

1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2,14000轉離心3分鐘。

1.7棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。

1.8向吸附柱中加入50ul趣純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘

2.濃度測定

資料僅供參考

2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。

2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。

2.3吸取lul待檢測樣品，滴加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。

3.酶切

3.1配制酶切體系

基因組40ul（約

500ng）

EcoRVlul

Buffer3.15ul

超純水4ul

總體積50ul

3.2混勻后，放于37度水浴鍋中，過夜酶切，約16-18小時。

4.電泳

4.1配制2%瓊脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘，

4.2成像觀察。

資料僅供參考

試驗3:BioTTTOOl基因組PCR及插入基因IL-12PCR驗證SOP

一、目的

利用PCR驗證BioTTTOOl的構建

二、試劑來源、配制及保存條件

試劑來源/品牌貨號存儲

BioTTTOOl深圳S160324A-80度

QIAmpDNAbloodminiQIAGEN51104室溫

kit

蛋白酶KTIANGEN040204度

2XMixVazyme102151-20度

引物（詳見附注）

資料僅供參考

DNAMarkerTIANGENlOObp4度

三、儀器設備

儀器品牌型號

離心機ThermoIECMICROMAX

微量分光光度計ThermoNANODROPONE

恒溫數(shù)顯水浴鍋晶玻HH-S2

振蕩器SCIENTIFICVORTEXGENIX2

INDUSTRIES

PCR儀Life2720Thermalcycler

technologies

瓊脂糖凝膠電泳儀北京六一DYY-6C

瓊脂糖凝膠成像儀Tanon3500

四、試驗過程

1.病毒基因組提取

1.1向200ulBioTTTOOl原液中加入10ul蛋白酶K,混勻。

1.2加入200ulALBuffer,震蕩15s混勻；輕微離心后，放入56度水浴鍋內(nèi)，

孵育10分鐘。

1.3加入200ul無水乙醇，震蕩15s混勻；輕微離心后，轉移樣品到新吸附柱

中。

1.4離心8000轉1分鐘，轉移吸附柱到新2ml離心管中。

1.5加入500ulBufferAW1,離心8000轉1分鐘。

1.6棄廢液，向吸附柱中加入500ulBufferAW2,14000轉離心3分鐘。

1.7棄廢液，空轉1分鐘；將吸附柱轉移到新的1.5ml離心管中。

1.8向吸附柱中加入50ul超純水，室溫靜置1分鐘，14000轉離心1分鐘

2.濃度測定

2.1吸取2ul超純水，滴到樣品檢測孔處，進行校準。

2.2抬起測量臂，擦拭殘留液體。

2.3吸取lul待檢測樣品，滿加到樣品檢測處，放下測量臂，記錄數(shù)據(jù)。

3.PCR

3.1配制PCR體系：

基因組0.5ul

2XMix2ul

Primer-Flul

Primer-Rlul

趣純水16.5ul

資料僅供參考

總體積20ul

3.2混勻后，放于PCR儀進行擴增，反應體系如

下：

94℃5min

94℃30s

55℃30s

72℃40s

72℃5min

4℃+oo

4.電泳

4.1配制2%瓊脂糖凝膠，120V電泳，約25-30分鐘,

4.2成像觀察。

附注：引物信息

資料僅供參考

PrimersetDirectionSequence

15,fbnvardCCCGGTGAGATTCCTCAAGAGGCCAC

3*reverseCCGGACCCAAGGCTCTCTGCTCTCCGGCTGCTCGGGC

25'forwardGTAATGTTGGCGGTGCAGGAAGGGATTG

3'reverseGGGTCCCCCGTATTCCTCCGGTGATAATGAC

35,fbnvardGTGTTCGCTTTGCTATATGAGGACCTGTGGC

3*reverseCCTCGATACATrCCACAGCCTGGCGACGCCCACC

45*forwardCCTGTGATTGCGTGTGTGG

3,reverseGACAACAGTAGCAGGCGATTC

55'forwardGCATCTGTGGAGAGCGGT1GTGAGACAC

3,reverseGCGCCAGCAGATCAAGCTCATTAGCGC

65'forwardGCTrAATGACCAGACACCGTCCTGAGTG

3'reverseGCACCAAGTGATCGGGCCTCAGCTCC

75,forwardCACCCTCACGCTCATCTGCAGCCTCATCACTGyGG

3'reverseCTTCAGACGGTCTTGCGCGCTTCATCTGC

85'forwardCGCTGGGGTCGCCACCCAAGATGATTAGG

3'reverseGAGTAGGGTACAGACCAAAGCGAGCACTG

95'forward第8對E3-gpl9k上游

3'reverse第11對nsIL12下游

105'forward第11對nsIL12上游

3'reverse第8對E3-gpl9k下游

115'forwardATGatatgggaactgaagaaag

3'reverseTTAGGAAGCATTCAGATAG

Primerset5'bindingsite3'bindingsiteTargetsequenceExpectedAd5size(bp)

J476853ElAstart377

27671029E1A-CR2262

310691453E1Aend384

415542086EIB-19K532

520732440E1B-55K367

623833434E1B-55K1051

72991531038E3B1123

82871529135E3-gpl9K.420

92871530109E3-1394

gpl9k+nsIL12

102853429135nsIL12+E3-601

資料僅供參考

gpl9k

112853430109nsIL121575

試驗4:BioTTTOOl插入基因IL-12表示檢測SOP(ELISA)

一、目的

資料僅供參考

利用ELISA檢測BioTTTOOl插入基因IL12的表示水平

二、試劑來源、配制及保存條件

試劑來源/品牌貨號/配制存儲

BioTTTOOl深圳S160324A-80度

DMEMGibco75510-0194度

FBSGEMINI900-108-20度

Penicillin-Gibco10378-016-20度

Streptomycin-

Glutamine(100X)

HumanIL12ELISAKIT