生物制藥之胰島素課件

生物制藥

之

胰島素生物制藥

之

1主要內(nèi)容1、胰島素簡介2、胰島素的功能作用3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用主要內(nèi)容1、胰島素簡介21.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細胞受內(nèi)源性或外源性物質(zhì)如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一種蛋白質(zhì)激素。胰島素是機體內(nèi)唯一降低血糖的激素，同時促進糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成。1.1、胰島素（insulin）定義：由胰島β細胞受內(nèi)源性31.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療的歷史。

1926年----重結(jié)晶胰島素

1930s----傳統(tǒng)中、長效動物胰島素

1970s----單峰胰島素和單組分胰島素

70年代末----半合成胰島素

1982年----采用基因重組技術(shù)生產(chǎn)的人胰島素正式上市。90年代至今----重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包括超短效和長效人胰島素類似物。

1.2、胰島素的發(fā)現(xiàn)1921年----從動物胰腺中提取出胰島41.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個肽鏈組成。人胰島素A鏈有11種21個氨基酸，B鏈有15種30個氨基酸，共26種51個氨基酸組成。其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四個半胱氨酸中的巰基形成兩個二硫鍵，使A、B兩鏈連接起來。此外A鏈中A6(Cys)與A11(Cys)之間也存在一個二硫鍵1.3、胰島素結(jié)構(gòu)組成胰島素由A、B兩個肽鏈組成。5人胰島素的一級結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級結(jié)構(gòu)人胰島素的一級結(jié)構(gòu)豬胰島素的一級結(jié)構(gòu)61.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer

）1.4、胰島素的空間構(gòu)型胰島素二聚體（dimer）胰72、胰島素的功能作用主要功能：2.1、調(diào)節(jié)糖代謝；2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝；2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝；2.4、其它功能2.5、體內(nèi)對抗胰島素的激素2、胰島素的功能作用主要功能：82.1、調(diào)節(jié)糖代謝

胰島素能促進全身組織細胞對葡萄糖的攝取和利用，并抑制糖原的分解和糖原異生，因此，胰島素有降低血糖的作用。2.1、調(diào)節(jié)糖代謝9胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進肌肉、脂肪組織等處的靶細胞細胞膜載體將血液中的葡萄糖轉(zhuǎn)運入細胞。（2）通過共價修飾增強磷酸二酯酶活性、降低cAMP水平、升高cGMP濃度，從而使糖原合成酶活性增加、磷酸化酶活性降低，加速糖原合成、抑制糖原分解。（3）通過激活丙酮酸脫氫酶磷酸酶而使丙酮酸脫氫酶激活，加速丙酮酸氧化為乙酰輔酶A，加快糖的有氧氧化。（4）通過抑制PEP羧激酶的合成以及減少糖異生的原料，抑制糖異生。（5）抑制脂肪組織內(nèi)的激素敏感性脂肪酶，減緩脂肪動員，使組織利用葡萄糖增加。胰島素降血糖是多方面作用的結(jié)果（1）促進肌肉、脂肪組織等處102.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進脂肪的合成與貯存，使血中游離脂肪酸減少，同時抑制脂肪的分解氧化。胰島素缺乏可造成脂肪代謝紊亂，脂肪貯存減少，分解加強，血脂升高，久之可引起動脈硬化，進而導(dǎo)致心腦血管的嚴重疾患；與此同時，由于脂肪分解加強，生成大量酮體，出現(xiàn)酮癥酸中毒。2.2、調(diào)節(jié)脂肪代謝胰島素能促進脂肪的合成與貯存，使血112.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進細胞對氨基酸的攝取和蛋白質(zhì)的合成，一方面抑制蛋白質(zhì)的分解，因而有利于生長。腺垂體生長激素的促蛋白質(zhì)合成作用，必須有胰島素的存在才能表現(xiàn)出來。因此，對于生長來說，胰島素也是不可缺少的激素之一。2.3、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝胰島素一方面促進細胞對氨基酸的122.4、其它功能胰島素可促進鉀離子和鎂離子穿過細胞膜進入細胞內(nèi)；可促進脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及三磷酸腺苷(ATP)的合成。2.4、其它功能胰島素可促進鉀離子和鎂離子穿過細胞膜進132.5、體內(nèi)對抗胰島素的激素體內(nèi)對抗胰島素的激素主要有胰升糖素、腎上腺素及去甲腎上腺素、腎上腺皮質(zhì)激素、生長激素等。它們都能使血糖升高。胰島素與胰高血糖素的拮抗作用2.5、體內(nèi)對抗胰島素的激素體內(nèi)對抗胰島素的激素主要有胰升糖143、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：3.1、提取目的基因3.2、提取質(zhì)粒3.3、基因重組3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌3.5、胰島素的產(chǎn)生3、利用大腸桿菌生產(chǎn)重組人胰島素提取步驟：153.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,可使用限制性內(nèi)切酶將目的基因從原DNA中分離。1.鳥槍法：用一大堆限制性核酸內(nèi)切酶對附近基因進行剪切，再提取所需要的。至于如何篩選，可用DNA分子雜交，即DNA探針。2.人工合成法：根據(jù)轉(zhuǎn)錄蛋白或者mRNA推導(dǎo)出基因序列，然后人工合成，沒有內(nèi)含子。3.從基因文庫中提?。阂簿褪鞘孪纫呀?jīng)提取完畢的拿來用。4.PCR擴增技術(shù)：用于大量生產(chǎn)該段基因片段，用于商業(yè)化運作。3.1、提取目的基因既從人的DNA中提取胰島素基因,163.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此質(zhì)粒將作為胰島素基因的載體。提取方法：

1.堿裂解法：在pH12.012.5這個狹窄的范圍內(nèi)，線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性。閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA，在變性后不會分離，復(fù)性快。2.煮沸法

：將細菌懸浮于含TritonX-100和能消化細胞壁的溶菌酶緩沖液中，然后加熱到100℃使其裂解。3.小量一步提取法：由于細菌染色體DNA比質(zhì)粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上，并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性，機械力后復(fù)性。但質(zhì)粒DNA的復(fù)性要快于細菌染色體DNA。3.2、提取質(zhì)粒從大腸桿菌的細胞質(zhì)中提取質(zhì)粒,質(zhì)粒為環(huán)狀。此173.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性內(nèi)切酶將質(zhì)粒切開,再使用DNA連接酶將目的基因與質(zhì)?！翱p合”,形成一個能表達出胰島素的DNA質(zhì)粒。3.3、基因重組取出目的基因與質(zhì)粒,先利用同種限制性183.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+的物質(zhì),如CaCl2,這使細胞會吸收外源基因.此時將重組的質(zhì)粒也放入培養(yǎng)液中,大腸桿菌便會將重組質(zhì)粒吸收.將大腸桿菌用氯化鈣處理，以增大大腸桿菌細胞壁的通透性，使含有目的基因的重組質(zhì)粒能夠進入受體細胞，此時的細胞處于感受態(tài)（理化方法誘導(dǎo)細胞，使其處于最適攝取和容納外來DNA的生理狀態(tài)）。3.4、將質(zhì)粒送回大腸桿菌在大腸桿菌的培養(yǎng)液中加入含有Ca+193.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達轉(zhuǎn)錄與翻譯后,便產(chǎn)生出胰島素蛋白質(zhì).通過大腸桿菌的大量繁衍,便可大量生產(chǎn)出胰島素!注意：大腸桿菌產(chǎn)出的是多肽鏈，因為原核生物沒有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等，不能進行多肽的折疊、修飾等，還需人為進行菌體外加工。3.5、胰島素的產(chǎn)生在大腸桿菌內(nèi),質(zhì)粒通過表達轉(zhuǎn)錄與翻譯后,20基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切

提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切基本

流程圖質(zhì)粒InsmRNA反轉(zhuǎn)錄InscDNA轉(zhuǎn)214、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用

4.1、固液分離技術(shù)4.2、菌體收集4.3、晶體收集4.4、前景展望4、新型固液分離技術(shù)在重組人胰島素生產(chǎn)中的應(yīng)用224.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近二十年來，中空纖維膜過濾技術(shù)在生物技術(shù)諸多應(yīng)用領(lǐng)域得到深入研究，其優(yōu)良的物理化學(xué)耐受性(Compatibility)、可放大性(Scalability)和工藝耐用性(Robustness)已得到國際生物制藥行業(yè)廣泛認可，有利于提高工藝放大成功率，改進生產(chǎn)效率，顯著降低生產(chǎn)成本。4.1、新型固液分離技術(shù)又稱：中空纖維膜過濾技術(shù)近23生物制藥之胰島素課件24應(yīng)用實例中空纖維膜過濾技術(shù)屬于現(xiàn)代生物分離技術(shù)，無篩網(wǎng)的管狀流道有效避免循環(huán)湍流，提供溫和剪切力的過濾方式，有利于保護蛋白活性和完整性；同時開放式的膜管結(jié)構(gòu)具有更高的容塵量，可以直接處理高固含量的復(fù)雜料液，常用于不同規(guī)模高密度發(fā)酵液的預(yù)處理和固液分離。如：高密度CHO細胞培養(yǎng)液澄清生產(chǎn)單克隆抗體；發(fā)酵液細胞或菌體收集；包涵體蛋白收集/洗滌；病毒類大分子溫和濃縮和洗濾等。應(yīng)用實例中空纖維膜過濾技術(shù)屬于現(xiàn)代生物分離技術(shù)，無篩254.2、菌體收集相比傳統(tǒng)離心操作，中空纖維膜過濾技術(shù)具有處理速度快、壽命長、設(shè)備日常維護簡單、可直接線性放大等特點，可以更好的滿足重組胰島素藥物生產(chǎn)過程中數(shù)十噸級規(guī)模發(fā)酵液菌體收集對生產(chǎn)工藝重復(fù)性、工藝可放大性和經(jīng)濟性的要求。對于固含量較高的粘稠料液，推薦選擇0.75mm(D柱)或1mm(E柱)纖維內(nèi)徑的濾膜。此工藝集成菌體收集和洗滌步驟，可以避免多次反復(fù)離心等繁冗操作，最終得到65%固含量(650g濕菌體/L)的菌體懸液，可直接用于接下來的細胞破碎步驟。目前，此工藝已經(jīng)成功線性放大到1000L以上的發(fā)酵規(guī)模。4.2、菌體收集相比傳統(tǒng)離心操作，中空纖維膜過濾技術(shù)具有處理26生物制藥之胰島素課件274.3、晶體收集傳統(tǒng)晶體收集方法是多步層析精細純化得到的胰島素在冷凍干燥之前，常采用多次結(jié)晶和洗滌工藝進一步去除雜質(zhì)、提高產(chǎn)品純度。

4.3、晶體收集傳統(tǒng)晶體收集方法是多步層析精細純化得28顯微鏡下的胰島素結(jié)晶體顯微鏡下的胰島素結(jié)晶體29采用中空纖維成功將重組胰島素晶體懸液進行高速濃縮收集以顯著減小體積，封閉的系統(tǒng)有利于保護產(chǎn)品不受外源因子污染，中空纖維0.45μm微濾膜表現(xiàn)出眾。高透過通量使得相對較小的膜面積和切向流系統(tǒng)處理較大體積料液成為可能，較小的系統(tǒng)將系統(tǒng)死體積降到最低，有利于進一步提高產(chǎn)品回收率。采用中空纖維成功將重組胰島素晶體懸液進行高速濃縮收集以304.4、前景展望盡管我國已成功建立超過30噸發(fā)酵體積的大規(guī)模重組人胰島素藥物生產(chǎn)線，但由于重組胰島素生產(chǎn)技術(shù)路