液體活檢在胰腺癌中的應(yīng)用課件

液體活檢在胰腺癌中的應(yīng)用

袁周上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院普外科1液體活檢在胰腺癌中的應(yīng)用袁周1胰腺癌流行病學(xué)胰腺癌發(fā)病率和死亡率逐年升高2008年世界癌癥死亡統(tǒng)計(jì)2012年世界癌癥死亡統(tǒng)計(jì)CACANCERJCLIN2011;61:69–90CACANCERJCLIN2015;65:87–1082胰腺癌流行病學(xué)胰腺癌發(fā)病率和死亡率逐年升高2008年世界癌癥2011年中國胰腺癌流行病學(xué)研究近年來上海市胰腺癌流行學(xué)研究11.13/10萬17.28/10萬9.91/10萬14.04/10萬中國腫瘤,2015,24(1):1-10CancerLetters346(2014)273–27732011年中國胰腺癌流行病學(xué)研究近年來上海市胰腺癌流行學(xué)研究液體活檢-胰腺癌診療新思路1.CancerDiscov;6(5);1–13DOI:10.1158/2159-8290.CD-15-14832.OncolRep2016;35(3):1237-444腫瘤篩查和早期診斷實(shí)時(shí)監(jiān)控治療反應(yīng)評(píng)估轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及預(yù)后指導(dǎo)靶向治療指導(dǎo)治療干預(yù)措施CTC和ctDNAExosomes液體活檢-胰腺癌診療新思路1.CancerDiscov;胰腺癌CTC研究5預(yù)后判斷治療監(jiān)測(cè)胰腺癌診斷CTC

cluster轉(zhuǎn)移機(jī)制耐藥性……IntJCancer2014;1;134(1):1-8胰腺癌CTC研究5預(yù)后判斷治療監(jiān)測(cè)胰腺癌診斷CTCcluCTC：胰腺癌診斷6利用數(shù)學(xué)模型對(duì)全基因組測(cè)序結(jié)果分析表明，胰腺癌發(fā)生到最后腫瘤轉(zhuǎn)移死亡過程需要經(jīng)過數(shù)十年1CTC可能在肉眼可見腫瘤形成之前進(jìn)入外周血，是腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”2IPMN和MCN作為PC癌前病變，這些患者可檢測(cè)到CTC3通過篩查高危人群CTC，加強(qiáng)隨訪，CTC陽性COPD患者最后發(fā)展為肺癌，能否實(shí)現(xiàn)胰腺癌早期診斷需要進(jìn)一步驗(yàn)證41.Nature.2010Oct28;467(7319):1114-72.Cell2012;148(1-2):349-613.Gastroenterology2014;146:647-514.PLoSOne.2014Oct31;9(10):e111597CTC：胰腺癌診斷6利用數(shù)學(xué)模型對(duì)全基因組測(cè)序結(jié)果分析表明，CTC：胰腺癌治療監(jiān)測(cè)7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：藥物有效治療后CTC數(shù)量顯著降低胰腺癌患者術(shù)后CTC先下降后上升，可能是因?yàn)闈摲膁isseminatedtumorcells再次被激活

PLoSOne.2014Feb19;9(2):e89474IntJCancer.2015Mar1;136(5):1228-33CTC：胰腺癌治療監(jiān)測(cè)7動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：藥物有效治療后CTC數(shù)CTC：胰腺癌預(yù)后8CTC陽性患者：總生存時(shí)間較差，HR=1.23；無進(jìn)展生存期更短，HR=1.89TumorBiol.(2014)35:2473–2480CTC：胰腺癌預(yù)后8CTC陽性患者：總生存時(shí)間較差，HR=1CellSearch檢測(cè)CTC判斷預(yù)后916名Ⅳb期PC患者，8名檢出CTCCTC陽性MST：52.5天CTC陰性MST:308.3天JHepatobiliaryPancreatSurg(2008)15:189–195

Annalsofoncology,2013,24(8):2057-206179名局部晚期PC，9名患者在基線或治療后2月檢測(cè)出CTC，檢出率11%CTC陽性O(shè)S較差P=0.01CellSearch檢測(cè)CTC判斷預(yù)后916名Ⅳb期PC患者CellSearch聯(lián)合表面分子標(biāo)記物更準(zhǔn)確判斷預(yù)后10經(jīng)典的CellSearch檢測(cè)CTC對(duì)轉(zhuǎn)移性PC的預(yù)后價(jià)值判斷有限結(jié)合MUC-1更好的對(duì)患者進(jìn)行危險(xiǎn)分層

Pancreas.2016Mar10DOI:10.1097/MPA.0000000000000619CellSearch聯(lián)合表面分子標(biāo)記物更準(zhǔn)確判斷預(yù)后10經(jīng)典CellSearch檢測(cè)CTC評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移在PC患者術(shù)后2-3年，術(shù)中門靜脈CTC陽性提示較高的較高肝轉(zhuǎn)移發(fā)生率（53vs.8%,p=0.038）CTC的數(shù)量變化輔助判斷不同手術(shù)方式效果，術(shù)前兩組門靜脈CTC無差異，術(shù)后標(biāo)準(zhǔn)手術(shù)組CTC升高而非接觸術(shù)式組CTC不變11(Medicine95(16):e3407)TumorBiol.(2015)36:991–996Medicine(Baltimore).2016Apr;95(16):e3407.doi:10.1097/MD.0000000000003407JAMASurg.2014May;149(5):482-5CellSearch檢測(cè)CTC評(píng)估腫瘤轉(zhuǎn)移在PC患者術(shù)后2-胰腺癌CTC檢測(cè)-CellSearch12CTC檢出率較低

晚期PC檢出率5%-42%

檢出數(shù)量較少

1-10個(gè)/7.5ml無法進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)在EMT過程中CK、EpCAM等上皮標(biāo)記物表達(dá)減少或消失，上皮表型細(xì)胞減少，間質(zhì)表型細(xì)胞增多胰腺癌為乏血供組織，血流量較正常胰腺組織減少約60%CTC通過門靜脈系統(tǒng)在肝臟內(nèi)被清除胰腺癌CTC檢測(cè)-CellSearch12在EMT過程中CK基于大小的胰腺癌CTC檢測(cè)13優(yōu)勢(shì)：檢出率高，檢出數(shù)量多；細(xì)胞完整性好；不受細(xì)胞表面標(biāo)記物影響；可檢出CTM；可進(jìn)行后續(xù)分析不足：不易檢出小于8μm的腫瘤細(xì)胞胰腺癌：ISET、ScreenCell等基于大小的胰腺癌CTC檢測(cè)13優(yōu)勢(shì)：檢出率高，檢出數(shù)量多；細(xì)ISET-結(jié)合多種表面標(biāo)記物確定CTC根據(jù)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)確定的CTC對(duì)PFS(P=0.85)和OS(P=0.36)

無判斷作用利用表面標(biāo)記物研究CTCEpithelialCTC：CK+/CD45-/＞15μm（78%），提示預(yù)后不良MesenchymalCTC：CK+/Vim+/CD45-/＞15μm（52%），提示術(shù)后復(fù)發(fā)更多標(biāo)記物值得去探究，如EMT過程中表達(dá)不下調(diào)的Plastin314BritishJournalofCancer(2012)106,508–516AnnSurg.2016Jan7,DOI:10.1097/SLA.0000000000001600CancerRes.2013Apr1;73(7):2059-69ISET-結(jié)合多種表面標(biāo)記物確定CTC根據(jù)腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)確ScreenCell-結(jié)合KRAS突變鑒別CTC15聯(lián)合細(xì)胞形態(tài)和KRAS突變檢測(cè)胰腺癌CTC，KRAS突變可以作為判定CTC分子學(xué)特征可在不同分期PC患者檢測(cè)到，檢出率較高，分別為73%-86%67%-73%的CTC檢出KRAS突變KRAS突變CTC與預(yù)后有關(guān)Pancreas2015;44:547–550TumourBiol2016;37(6):7547-54ScreenCell-結(jié)合KRAS突變鑒別CTC15聯(lián)合細(xì)胞SE-iFISH方法檢測(cè)CTC16SE-iFISH：差相富集技術(shù)聯(lián)合免疫熒光染色及染色體熒光原位雜交技術(shù)SE-iFISH方法檢測(cè)CTC16SE-iFISH：差相富CTC鑒定方法CK是上皮細(xì)胞來源標(biāo)記物，免疫染色為綠色CD45白細(xì)胞表面的共同抗原，免疫染色為紅色DAPI用于標(biāo)記細(xì)胞核，染色呈現(xiàn)藍(lán)色8號(hào)染色體多倍性是胰腺癌一個(gè)重要特征，F(xiàn)ISH染色為橙色CTC的表型：CK+/CD45-/DAPI+/CEP8=2，

CK+/CD45-/DAPI+/CEP8>2，CK-/CD45-/DAPI+/CEP8>2白細(xì)胞的表型為CK-/CD45+/DAPI+/CEP8=2；未定性細(xì)胞表型為CK-/CD45-/DAPI+/CEP8=217CTC鑒定方法CK是上皮細(xì)胞來源標(biāo)記物，免疫染色為綠色17典型細(xì)胞圖像白色箭頭所示為CTC，紅色箭頭所示為白細(xì)胞，綠色箭頭所示為未定性細(xì)胞18典型細(xì)胞圖像白色箭頭所示為CTC，紅色箭頭所示為白細(xì)胞，綠色CTC計(jì)數(shù)診斷胰腺癌ROC曲線ROC曲線下面積0.954當(dāng)CTC計(jì)數(shù)臨界值為2個(gè)/7.5ml，約登指數(shù)最大，為1.78CTC＜2個(gè)/7.5ml定義為CTC陰性，CTC≥2個(gè)/7.5ml定義為CTC陽性19CTC計(jì)數(shù)診斷胰腺癌ROC曲線ROC曲線下面積0.95419CTC陽性率與臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系20CTC陽性率與臨床病理學(xué)參數(shù)關(guān)系20聯(lián)合CTC計(jì)數(shù)與CA19-9診斷胰腺癌21聯(lián)合CTC計(jì)數(shù)與CA19-9診斷胰腺癌21CTC計(jì)數(shù)與胰腺癌生存時(shí)間關(guān)系本組患者中位時(shí)間生存時(shí)間為10.2月（3.9-21.6月）CTC＜3個(gè)/7.5ml的患者中位生存時(shí)間15.2月（8.4-21.2月）CTC≥3個(gè)/7.5ml的患者中位生存時(shí)間10.2月（3.9-16.4月）22CTC計(jì)數(shù)與胰腺癌生存時(shí)間關(guān)系本組患者中位時(shí)間生存時(shí)間為10Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型CTC≥3個(gè)/7.5ml（HR=4.547；P=0.016）和Ⅲ-Ⅳ期腫瘤（HR=2.742；P=0.012）是胰腺癌不良預(yù)后的獨(dú)立判斷因素JExpClinCancerRes.2016Apr12;35(1):6623Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型CTC≥3個(gè)/7.5ml（HR=4.5CTC：腫瘤耐藥性在NSCLC中，CDX小鼠模型(CTCderivedxenograft)對(duì)化療藥物反應(yīng)類似提供CTC的患者，便于檢測(cè)化療耐藥性在乳腺癌中，培養(yǎng)CTC細(xì)胞系，進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，難治性腫瘤的提供新治療藥物，進(jìn)行個(gè)性化治療方案通過對(duì)接受和未接受AR(androgenreceptor)抑制劑治療的前列腺癌患者CTC，發(fā)現(xiàn)非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路激活，Wnt5a異常表達(dá)抑制藥物療效241.NatMed.2014Aug;20(8):897-9032.Science.2014Jul11;345(6193):216-203.Science.2015Sep18;349(6254):1351-6CTC：腫瘤耐藥性在NSCLC中，CDX小鼠模型(CTCCTC在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)中的作用25Nature.2016Jan21;529(7586):298-306CTC在腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)中的作用25Nature.2016JaCTC：腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制在前列腺癌中，CTC全外顯子組測(cè)序揭示70%的CTC突變與腫瘤組織一致在乳腺癌CTC中分離出MIC（metastasis-initiatingcells），證實(shí)EPCAM+/CD44+/CD47+/MET+類型細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性

在胰腺癌中，利用RAN-Seq分析鑒定出非經(jīng)典Wnt途徑在胰腺癌中的作用，抑制Wnt2基因有可能抑制轉(zhuǎn)移腫瘤可以通過CTC進(jìn)行自我種植（self-seeding），進(jìn)而促進(jìn)腫瘤增大，血管生成等261.NatBiotechnol.2014May;32(5):479-842.NatBiotechnol.2013Jun;31(6):539-443.Nature.2012Jul26;487(7408):510-34.Cell.2009Dec24;139(7):1315-26CTC：腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制在前列腺癌中，CTC全外顯子組測(cè)序揭示7CTC：腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制27胰腺癌CTC的RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)：CTC高度表達(dá)間質(zhì)來源的

胞外基質(zhì)蛋白SPARC促進(jìn)胰腺癌的轉(zhuǎn)移前列腺癌CTC的RNA-Seq分析發(fā)現(xiàn)CTC中的相關(guān)信號(hào)通路1.CellRep.2014Sep25;8(6):1905-182.Science.2015Sep18;349(6254):1351-6CTC：腫瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制27胰腺癌CTC的RNA-Seq分析發(fā)CTCcluster在乳腺癌中，CTCcluster轉(zhuǎn)移能力大約是單個(gè)CTC的50倍，

plakoglobin(斑珠蛋白)在形成中其關(guān)鍵作用，表達(dá)降低后腫瘤轉(zhuǎn)移能力顯著下降CTCcluster與血小板、白細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞共同構(gòu)成特有微環(huán)境，可以抑制失巢凋亡CTCcluster提示患者預(yù)后較差

281.Cell.2014Aug28;158(5):1110-222.TrendsinCancer,2015,1(1):44-52CTCcluster在乳腺癌中，CTCcluster轉(zhuǎn)ctDNA：臨床應(yīng)用前景廣泛29早期診斷，檢測(cè)殘余病灶動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)；指導(dǎo)靶向用藥判斷預(yù)后ClinChem.2015Jan;61(1):112-23ctDNA：臨床應(yīng)用前景廣泛29早期診斷，檢測(cè)殘余病灶動(dòng)態(tài)監(jiān)ctDNA：檢測(cè)方法日新月異30數(shù)字PCR計(jì)數(shù)提高稀有突變檢出率，提高檢測(cè)的深度NGS計(jì)數(shù)可以性檢測(cè)多個(gè)靶基因，尤其是靶向深度測(cè)序，提高檢測(cè)廣度JClinOncol.2014Feb20;32(6):579–586ctDNA：檢測(cè)方法日新月異30數(shù)字PCR計(jì)數(shù)提高稀有突變檢Kras基因?yàn)橐认侔┲匾?qū)動(dòng)基因31Trendsinbiochemicalsciences,2014,39(2):91-100Kras基因?yàn)橐认侔┲匾?qū)動(dòng)基因31Trendsinbi液體活檢檢測(cè)KRAS對(duì)PC預(yù)后有

更強(qiáng)的判斷能力32KRAS來源液體活檢腫瘤組織總突變新鮮腫瘤組織FFPE風(fēng)險(xiǎn)比3.161.371.622.011.29MedOncol(2016)33:61DOI10.1007/s12032-016-0777-1液體活檢檢測(cè)KRAS對(duì)PC預(yù)后有

更強(qiáng)的判斷能力32KRASddPCR檢測(cè)ctDNA105例PDAC手術(shù)患者，腫瘤組織KRAS突變率82%，ctDNA突變率33%，與腫瘤在組織符合率100%腫瘤組織KRAS突變無判斷預(yù)后作用（P=0.18），ctDNA的KRAS突變可判斷預(yù)后（13.6月vs27.6月，P＜0.001）不同KRAS突變亞型的患者OS無顯著差別33BrJCancer.2016Jun28;115(1):59-65ddPCR檢測(cè)ctDNA105例PDAC手術(shù)患者，腫瘤組織KctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病情變化ctDNA與CA19-9水平有很好的相關(guān)性(Spearman’srho=0.786,P=0.021)ctDNA較影像學(xué)平均提前6.5月發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展34MolOncol.2016Apr;10(4):635-43NatCommun.2015Jul7;6:7686ctDNA動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)病情變化ctDNA與CA19-9水平有34ctDNA指導(dǎo)靶向用藥35SciRep.2015Dec16;5:18425NatCommun.2015Jul7;6:7686ctDNA反映胰腺癌突變基因類型，可使更多患者有可能得到靶向治療大約三分之一患者有可用靶向藥ctDNA指導(dǎo)靶向用藥35SciRep.2015Dec胰腺癌靶向深度測(cè)序Panel36胰腺癌靶向深度測(cè)序Panel36基于ctDNA的靶向用藥結(jié)果EGFR外顯子19缺失與厄洛替尼敏感有關(guān)ctDNA提前檢測(cè)到該突變，后經(jīng)活檢證實(shí)，予以厄洛替尼治療結(jié)果CA19-9正常，腫瘤縮小，病情緩解37CancerDiscov.2015Oct;5(10):1040-8基于ctDNA的靶向用藥結(jié)果EGFR外顯子19缺失與厄洛替尼基于ctDNA的靶向藥物試驗(yàn)BRAFV600E突變?cè)谝认侔┲斜壤?%，不與KRAS突變共存，是Vemurafenib批準(zhǔn)用于治療黑色素瘤的靶點(diǎn)取BRAFV600E突變患者腫瘤細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)和黑素偶細(xì)胞系MNT-1對(duì)Vemurafenib有類似敏感性，而KRAS突變細(xì)胞系PL-45則無反應(yīng)38NatCommun.2015Apr9;6:6744基于ctDNA的靶向藥物試驗(yàn)BRAFV600E突變?cè)谝认侔┦澜绶秶鷥?nèi)的精準(zhǔn)醫(yī)療熱潮澳大利亞針對(duì)晚期胰腺癌患者進(jìn)行TheIndividualizedMolecularPancreaticCancerTherapy(IMPaCT)試驗(yàn)，

帥選出HER2擴(kuò)增;KRAS野生型;DNA修復(fù)通路基因突變(BRCA1,BRCA2,PALB2,ATM)患者進(jìn)行靶向治療，有可能通過液體活檢輔助精準(zhǔn)靶向治療美國NCI正在組織進(jìn)行MATCH(MolecularAnalysisforTherapyChoice)試驗(yàn)，計(jì)劃帥選3000名實(shí)體腫瘤患者，最終根據(jù)突變類型給予靶向藥物治療39ClinCancerRes.2015May1;21(9):2029-37SeminOncol.2014Jun;41(3):297-9世界范圍內(nèi)的精準(zhǔn)醫(yī)療熱潮澳大利亞針對(duì)晚期胰腺癌患者進(jìn)行The我們開展的研究CTC驗(yàn)證CTC對(duì)PC診斷和預(yù)后判斷作用探究CTC監(jiān)測(cè)PC的病情變化和治療反應(yīng)ctDNActDNA、CTC、腫瘤組織的基因突變比較利用ctDNA研究PC診斷、治療反應(yīng)、病情監(jiān)測(cè)和預(yù)后判斷情況NGS全外顯子組檢測(cè)胰腺癌腫瘤的突變研究新發(fā)突變的分子流行病學(xué)情況進(jìn)行相關(guān)的靶向藥物的臨床試驗(yàn)40我們開展的研究CTC驗(yàn)證CTC對(duì)PC診斷和預(yù)后判斷作用探究C部分檢測(cè)結(jié)果41Sanger法ddPCR法部分檢測(cè)結(jié)果41Sanger法ddPCR法部分檢測(cè)結(jié)果42ARMS法部分檢測(cè)結(jié)果42ARMS法外泌體組成43外泌體是一種直徑為30～100nm的膜性小囊泡，可由機(jī)體中的多種細(xì)胞分泌，并廣泛分布于唾液、血漿和乳汁等體液中。相關(guān)研究登記在/AnnuRevCellDevBiol.2014;30:255-89外泌體組成43外泌體是一種直徑為30～100nm的外泌體分離方法離心法：收集細(xì)胞培養(yǎng)液以后依次在300g、2000g、10000g離心去除細(xì)胞碎片和大分子蛋白質(zhì)，最后100000g離心得到外泌體過濾離心：利用不同截留相對(duì)分子質(zhì)量(MWCO)的超濾膜離心分離外泌體密度梯度離心：將樣本和梯度材料一起超速離心，樣品中的不同組分沉降到各自的等密度區(qū)，分為連續(xù)和不連續(xù)梯度離心法免疫磁珠：包被有單克隆抗體的球型磁性微粒，可特異性地與靶物質(zhì)結(jié)合色譜法：利用根據(jù)凝膠孔隙的孔徑大小與樣品分子尺寸的相對(duì)關(guān)系而對(duì)溶質(zhì)進(jìn)行分離的分析的方法44外泌體分離方法離心法：收集細(xì)胞培養(yǎng)液以后依次在300g、2胰腺癌外泌體研究Landmark45德克薩斯大學(xué)M.D.安德森癌癥中心胰腺癌外泌體研究Landmark45德克薩斯大學(xué)M.D.安外泌體早期診斷46PKT小鼠模仿人類胰腺癌發(fā)展過程，4.5周時(shí)形成PanIN，8周時(shí)死于PDACGPC1+外泌體的比例隨著腫瘤體積增大和組織學(xué)分化變差而不斷升高外泌體的濃度與大小同樣與病情進(jìn)展相關(guān)系較差外泌體含有KRAS突變且在胰腺癌早期階段升高，可以作為理想的胰腺癌早期診斷標(biāo)記物Nature.2015Jul9;523(7559):177-82外泌體早期診斷46PKT小鼠模仿人類胰腺癌發(fā)展過程，4.5周外泌體用于胰腺癌診斷47GPC1+外泌體比例在鑒別胰腺導(dǎo)管腺癌與胰腺良性疾病和正常人群的靈敏度和特異度為100%。GPC1+外泌體比例對(duì)于不同分期（原位癌、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期腫瘤的靈敏度和特異度均為100%）外泌體濃度及大小無法有效鑒別外泌體用于胰腺癌診斷47GPC1+外泌體比例在鑒別胰腺導(dǎo)外泌體提示腫瘤負(fù)荷4828/29的PDAC和全部PCPL術(shù)后GPC1+外泌體均下降19/29的PDAC和0個(gè)PCLC患者術(shù)后CA19-9水平下降外泌體提示腫瘤負(fù)荷4828/29的PDAC和全部PCPL術(shù)后外泌體變化判斷胰腺癌預(yù)后49GPC1+