臨床分子生物學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)講義

實(shí)驗(yàn)一實(shí)驗(yàn)要求與生物安全（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備——預(yù)習(xí)并復(fù)習(xí)PCR的反應(yīng)原理及基本過程（二）實(shí)驗(yàn)要求——嚴(yán)肅認(rèn)真、安全規(guī)范1、不遲到早退、不無故缺席、按要求著白大褂2、保持安靜和秩序、不在教室接聽手機(jī)和喧嘩3、聽從安排，嚴(yán)格遵守操作規(guī)程4、公用物品及時(shí)放回5、愛護(hù)儀器設(shè)備、保持清潔衛(wèi)生6、注重儀器和試劑使用的安全操作中注意事項(xiàng)：注意無菌操作并防止RNase污染注意移液器（槍）的使用注意離心機(jī)必須平衡防止試劑造成皮膚傷害實(shí)驗(yàn)二乙型肝炎病毒(HBV)核酸擴(kuò)增(PCR)熒光定量檢測(cè)【標(biāo)本采集】樣品可采用血清或血漿樣本，血漿采用3%枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑：血液為1：9?！静僮鞑襟E】待測(cè)樣品處理（將［陰性對(duì)照］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品①］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品②］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品③］、［工作標(biāo)準(zhǔn)品④］與待測(cè)標(biāo)本同步進(jìn)行處理）(在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行)1.1用帶濾芯吸嘴吸取100μl［樣品處理液A］于0.5ml離心管中。1.2加入100μl被測(cè)標(biāo)本。1.3蓋上管蓋，振蕩混勻，13000rpm離心10分鐘（離心時(shí)固定離心管方向）。1.4吸棄上清（沉淀不明顯，需在離心管底部沉淀對(duì)側(cè)吸上清，應(yīng)一次吸盡上清，避免攪動(dòng)或碰到沉淀）。1.5再加入25μl［樣品處理液B］。1.6振蕩混勻，低速（2000rpm）離心數(shù)秒后，100℃干浴或沸水浴101.713000rpm離心10分鐘，取上清為PCR反應(yīng)模板。（上清如不立即使用，須置-20℃保存,重新使用時(shí)需13000rpm離心102.PCR試劑準(zhǔn)備（在PCR前準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）2.1取試劑盒中［PCR反應(yīng)液A］、［PCR反應(yīng)液B］、［PCR反應(yīng)液C］室溫融化混勻后，低速（2000rpm）離心數(shù)秒。2.2根據(jù)待擴(kuò)增樣品數(shù)按［PCR反應(yīng)液A］：［PCR反應(yīng)液B］：［PCR反應(yīng)液C］=13.5：13.5：1的比例配制PCR反應(yīng)液，并分裝至PCR反應(yīng)管中，每管28μl，將裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。3.加樣（在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行）在裝有PCR反應(yīng)液的反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入2μl已處理好的標(biāo)本（標(biāo)本處理步驟1.7的上清）。蓋上管蓋，轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。4.PCR擴(kuò)增檢測(cè)（在擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）將反應(yīng)管放入熒光PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。循環(huán)參數(shù)設(shè)定：（請(qǐng)參照各類儀器的操作軟件進(jìn)行設(shè)置）步驟溫度時(shí)間循環(huán)數(shù)1UNG酶反應(yīng)502分鐘12預(yù)變性942分鐘13變性9410秒40退火、延伸及檢測(cè)熒光6030秒4儀器冷卻3510秒1步驟3中60℃時(shí)熒光檢測(cè)，檢測(cè)通道：530nm（FAM）4.3樣品設(shè)置在儀器軟件的相應(yīng)樣品設(shè)置窗口內(nèi)填寫各樣品的名稱、類型及工作標(biāo)準(zhǔn)品參數(shù)（見試劑盒內(nèi)提示）。【結(jié)果分析】根據(jù)各類儀器的軟件進(jìn)行分析，得到各標(biāo)本的HBVDNA檢測(cè)結(jié)果。（基線選取6～10或6～15個(gè)循環(huán)，閾值線選在陰性對(duì)照正常擴(kuò)增曲線的上方）【結(jié)果判斷】1.對(duì)于500≤測(cè)定拷貝數(shù)＜108拷貝/ml的樣本，報(bào)告相應(yīng)的測(cè)定結(jié)果。2.對(duì)于測(cè)定拷貝數(shù)≥108拷貝/ml的樣本，所測(cè)結(jié)果僅供參考，報(bào)告上注明≥108拷貝/ml。若需精確定量，可根據(jù)所測(cè)結(jié)果，將該標(biāo)本用陰性血清稀釋至105～106拷貝/ml后復(fù)測(cè)。3.對(duì)于測(cè)定拷貝數(shù)＜500拷貝/ml的樣本，所測(cè)結(jié)果僅供參考，報(bào)告上注明＜500拷貝/ml或低于試劑盒檢測(cè)下限。4.對(duì)于HBV擴(kuò)增陰性的標(biāo)本（Ct無數(shù)值），報(bào)告上注明＜500拷貝/ml或低于試劑盒檢測(cè)下限。【注意事項(xiàng)】1.待檢新鮮血清或血漿若不及時(shí)檢測(cè),應(yīng)保存于-20℃。2.試劑盒各組份使用前請(qǐng)充分融化并搖勻,離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用。3.PCR操作各階段應(yīng)在不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域進(jìn)行，包括PCR擴(kuò)增試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本處理區(qū)及PCR擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。4.在標(biāo)本處理階段建議使用負(fù)壓超凈臺(tái)。5.應(yīng)穿工作服，戴一次性手套（經(jīng)常替換手套），使用一次性用品。6.PCR操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗(yàn)和受過培訓(xùn)。7.操作過程中用到的超凈臺(tái)、移液器、離心機(jī)、擴(kuò)增儀等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或70%乙醇及紫外燈處理。8.實(shí)驗(yàn)中廢棄的吸嘴應(yīng)棄于含10%次氯酸的廢液缸中,以防止污染。9.陰性對(duì)照、工作標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)和待檢標(biāo)本平行進(jìn)行操作后方可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。10.使用本試劑盒檢測(cè)，請(qǐng)按傳染病實(shí)驗(yàn)室檢查規(guī)程操作。11.血清標(biāo)本的測(cè)定結(jié)果比血漿標(biāo)本測(cè)定結(jié)果略低。實(shí)驗(yàn)三丙型肝炎病毒核酸擴(kuò)增(PCR)-熒光定量檢測(cè)原理與用途本品從血清或血漿中提取HCVRNA，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA逆轉(zhuǎn)錄為HCVcDNA，在引物的指導(dǎo)下，以四種脫氧核苷酸為底物，通過耐熱DNA聚合酶的酶促作用，對(duì)cDNA進(jìn)行體外擴(kuò)增。用Taqman探針法檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。工作標(biāo)準(zhǔn)品為HCVRNA，采用外標(biāo)的方法定標(biāo)。本品的定量檢測(cè)范圍為103～107IU/ml，本品用于定量檢測(cè)血清或血漿標(biāo)本中的丙型肝炎病毒RNA，可作為丙型肝炎的輔助診斷及療效監(jiān)控。樣本種類、采集和保存方法至-80℃凍存。標(biāo)本應(yīng)于操作步驟標(biāo)本處理(所有操作需采用無RNA酶的帶濾芯吸嘴及離心管，在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備1.1將裂解液置70℃加熱5分鐘，使試劑瓶?jī)?nèi)的結(jié)晶全部溶解。吸取1ml裂解液加到助沉劑的試劑瓶中，用吸嘴攪動(dòng)，混勻后全部吸回到裂解液瓶中，混勻后備用。1.2在去抑制劑的試劑瓶中加入700用吸嘴攪動(dòng)，1.3在洗滌液A的瓶子中加入6ml無水乙醇，顛倒混勻后備用。1.4在洗滌液B的瓶子中加入16ml無水乙醇，顛倒混勻后備用。2病毒RNA提取2.1取N個(gè)0.5ml離心管（N=標(biāo)本數(shù)量+陰性對(duì)照、強(qiáng)陽性對(duì)照、弱陽性對(duì)照和4個(gè)工作標(biāo)準(zhǔn)品），作好標(biāo)記后分別加入100入100入20去抑制劑用帶濾芯吸嘴加入110無水乙醇，振蕩混勻，離心數(shù)秒。2.5將作好標(biāo)記的核酸提取柱插入連接管后，固定在負(fù)壓裝置上，將步驟2.4中的所有液體小心移入核酸提取柱。注意不要將液體濺入其它樣品的核酸提取柱內(nèi)。2.6開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.7在每個(gè)核酸提取柱內(nèi)加入500μl洗滌液A，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.8在每個(gè)核酸提取柱內(nèi)加入500μl洗滌液B，開啟負(fù)壓，讓核酸提取柱內(nèi)的液體全部抽干。2.9從連接套管上取下核酸提取柱，將其放入無RNA酶的2ml離心管中，蓋上管蓋，14000rpm離心1分鐘。2.10將提取柱放入一新的2ml離心管中（確保采用無RNA酶的離心管），小心將50μl洗脫液加在柱面中央，靜置1分鐘。2.11蓋上管蓋，10000rpm離心1分鐘，取2ml離心管中的收集液12.5μl做PCR反應(yīng)模板。RT-PCR試劑準(zhǔn)備（在PCR前準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行）從試劑盒中取出PCR主反應(yīng)液、酶混合物和熒光探針,室溫下融化后離心數(shù)秒,按照待擴(kuò)增標(biāo)本數(shù)量x，取PCR主反應(yīng)液:酶混合物:熒光探針=7:5:0.5混合，充分混勻后離心數(shù)秒，分裝至PCR毛細(xì)反應(yīng)管中，每管12.5μl，將裝有PCR反應(yīng)液的毛細(xì)反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至標(biāo)本處理區(qū)。RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液配制表擴(kuò)增樣品數(shù)PCR主反應(yīng)液酶混合物熒光探針合計(jì)1077μl55μl5.5μl137.5μl20154μl110μl11μl275μl30231μl165μl16.5μl412.5μl32245μl175μl17.5μl437.5μl加樣（在標(biāo)本處理區(qū)進(jìn)行）1.在裝有PCR反應(yīng)液的毛細(xì)反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入12.5μl已處理好的標(biāo)本（標(biāo)本處理步驟2.11離心管中的洗脫液）。蓋上管蓋，離心數(shù)秒后轉(zhuǎn)移到擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)。PCR擴(kuò)增檢測(cè)（在擴(kuò)增檢測(cè)區(qū)進(jìn)行）1.將毛細(xì)管放入LightCycler擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。2.循環(huán)參數(shù)設(shè)定：ProgramCyclesTemperatureTarget（℃）HoldTime（min：sec）Slope（℃/sec）AcquisitionMode115025：0020None21942：0020None3593320None55152None721520None44293320None604520Single51403020None3.熒光檢測(cè)通道：F1。結(jié)果獲取1.選F1或F1/F2通道，點(diǎn)擊Quantification按紐，進(jìn)入數(shù)據(jù)分析界面。2.在數(shù)據(jù)分析窗口中，將噪音線NoiseBand的位置移至剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)，且CT值不出現(xiàn)任何數(shù)值為準(zhǔn)（可根據(jù)儀器本身的實(shí)際情況加以調(diào)整），得到各標(biāo)本的HCVRNA檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果判斷本品的檢測(cè)靈敏度為500IU/ml，定量測(cè)定范圍為103～107IU/ml。1.定性結(jié)果判斷：測(cè)定結(jié)果為0（無數(shù)值）的標(biāo)本為HCVRNA陰性標(biāo)本。測(cè)定結(jié)果≥500IU/ml的標(biāo)本為HCVRNA陽性標(biāo)本。2.定量結(jié)果判斷：對(duì)于103≤測(cè)定結(jié)果≤107IU/ml的樣本，提示本次測(cè)定結(jié)果在試劑盒有效定量檢測(cè)線性范圍內(nèi)。報(bào)告上注明其測(cè)定結(jié)果。對(duì)于測(cè)定結(jié)果＞107IU/ml的樣本，提示病毒含量高于試劑盒定量檢測(cè)線性范圍上限，所測(cè)結(jié)果僅供參考，報(bào)告上注明＞107IU/ml。若需精確定量，可根據(jù)所測(cè)結(jié)果，將該標(biāo)本用陰性血清稀釋至104～106IU/ml后復(fù)測(cè)。對(duì)于500≤測(cè)定結(jié)果＜103IU/ml的樣本，提示病毒含量低于試劑盒定量檢測(cè)線性范圍下限，所測(cè)結(jié)果僅供參考，報(bào)告上注明＜103IU/ml,建議隨訪。測(cè)定結(jié)果為0(無數(shù)值)的標(biāo)本為HCVRNA陰性標(biāo)本。注意事項(xiàng)1待檢新鮮血標(biāo)本若不及時(shí)檢測(cè),應(yīng)保存于-20℃2試劑盒各組份使用前請(qǐng)充分融化并搖勻,離心管內(nèi)的試劑需離心數(shù)秒后使用。3PCR操作各階段應(yīng)