pcr的溫度設(shè)置課件

溫度與時間的設(shè)置溫度與時間的設(shè)置1設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性，再迅速冷卻至40～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃，在TaqDNA聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸對于較短靶基因（長度為100～300bp時）可采用二溫度點法，將退火與延伸溫度合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點2①變性溫度與時間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最主要原因一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性若低于93℃則需延長時間但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物完全變性，就會導(dǎo)致PCR失?、僮冃詼囟扰c時間變性溫度低，解鏈不完全是導(dǎo)致PCR失敗的最3②退火(復(fù)性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想②退火(復(fù)性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要4②退火(復(fù)性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞退火溫度與時間，取決于引物的長度、堿基組成及其濃度，還有靶基序列的長度對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想②退火(復(fù)性)溫度與時間退火溫度是影響PCR特異性的較重要5引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度Tm值（解鏈溫度）=4（G+C）＋2（A+T）復(fù)性溫度=Tm值-（5～10℃）在Tm值允許范圍內(nèi)，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合，提高PCR反應(yīng)的特異性復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間完全結(jié)合引物的復(fù)性溫度

通過以下公式幫助選擇合適的溫度Tm值（解鏈溫6③延伸溫度與時間TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

70～80℃150核苷酸/S/酶分子

70℃60核苷酸/S/酶分子

55℃24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時，DNA合成幾乎不能進行③延伸溫度與時間TaqDNA聚合酶的生物學(xué)活性：

7③延伸溫度與時間：延伸溫度：一般選擇在70～75℃之間常用溫度為72℃過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。延伸反應(yīng)時間：根據(jù)待擴增片段長度而定1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min（足夠）3～4kb的靶序列需3～4min擴增10Kb需延伸至1