2011CB964800-G造血干細(xì)胞維持、衰老與再生的調(diào)控機(jī)制研究

項(xiàng)目名稱：造血干細(xì)胞維持、衰老與再生的調(diào)控機(jī)制研究首席科學(xué)家：程濤中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）起止年限：2011.1至2015.8依托部門：衛(wèi)生部二、預(yù)期目標(biāo)本項(xiàng)目的總體目標(biāo)：通過對(duì)HSC發(fā)育、維持、衰老及再生調(diào)控機(jī)制的研究，在理論上闡釋組織干細(xì)胞在機(jī)體衰老和再生修復(fù)中的重要的生物學(xué)基礎(chǔ)；在技術(shù)方法上為其它組織干細(xì)胞研究引領(lǐng)新的方向，提供新的分子靶點(diǎn)及可以借鑒的新方法新技術(shù)；在應(yīng)用策略上將探索HSC及iPS細(xì)胞在體外高效、安全的擴(kuò)增與定向分化的新策略。最終促使我國在干細(xì)胞特別是HSC調(diào)控研究領(lǐng)域達(dá)到國際領(lǐng)先水平，形成自己的特色和亮點(diǎn)。同時(shí)，以本項(xiàng)目為紐帶，促進(jìn)多學(xué)科、多院校的合作和交流，大力扶持和使用青年科技骨干，造就出一批優(yōu)秀的干細(xì)胞研究人才。五年預(yù)期目標(biāo)：1、利用本團(tuán)隊(duì)已建立的小鼠模型，通過對(duì)p53-p21途徑和p16-pRb途徑等HSC維持的內(nèi)在調(diào)控機(jī)制及成骨細(xì)胞、MSC及其分泌因子等HSC外在調(diào)控的機(jī)制的研究，闡釋HSC維持的內(nèi)、外調(diào)控機(jī)制及完整網(wǎng)絡(luò)，并從關(guān)鍵分子及機(jī)制入手，為對(duì)抗骨髓衰竭和促進(jìn)再生策略的研究提供理論基礎(chǔ)。2、利用端粒酶、ATM和GADD45a基因敲除小鼠模型，研究衰老和損傷應(yīng)激狀態(tài)下HSC端?？s短和內(nèi)源性ROS升高的原因，闡釋HSC衰老的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制，重點(diǎn)研究引起HSC衰老的關(guān)鍵分子信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)制，為抗衰老研究策略提供理論基礎(chǔ)。3、應(yīng)用斑馬魚和小鼠等模式生物，篩選出2-6個(gè)參與HSC發(fā)育調(diào)控的關(guān)鍵“節(jié)點(diǎn)”基因；明確若干HSC維持和衰老的重要調(diào)控分子在HSC發(fā)育中的作用；通過制備具有體內(nèi)示蹤功能的新型模式小鼠，闡明不同位點(diǎn)對(duì)造血系統(tǒng)發(fā)育的生理性貢獻(xiàn)。4、探討不同衰老程度的HSC與iPS細(xì)胞生成的關(guān)系，闡明衰老對(duì)HSC重編程能力及所產(chǎn)生的iPS細(xì)胞多能性的影響；對(duì)iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的機(jī)制進(jìn)行探討，從而優(yōu)化誘導(dǎo)分化條件，提出基于iPS細(xì)胞的HSC再生新策略。5、取得具有國際影響的原創(chuàng)性成果,預(yù)期在國內(nèi)外專業(yè)期刊上發(fā)表高水平論文，其中在國際一流學(xué)術(shù)刊物(IF>10)上發(fā)表論文15篇以上，在有影響力的雜志(IF>5)上發(fā)表論文30篇以上。申請(qǐng)專利15項(xiàng)以上。6、預(yù)計(jì)培養(yǎng)博士后15-20人，博士研究生30-50人及一批學(xué)術(shù)水平高、創(chuàng)新能力強(qiáng)的中青年學(xué)術(shù)骨干,為造血干細(xì)胞研究成立一支具有國際影響力的高水平研究隊(duì)伍。三、研究方案（一）學(xué)術(shù)思路：正常HSC的穩(wěn)態(tài)維持、自我更新與分化是一個(gè)復(fù)雜的生理現(xiàn)象，由內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制及外源性調(diào)控機(jī)制所共同形成的的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在HSC的穩(wěn)態(tài)維持、自我更新及定向分化的過程中發(fā)揮重要作用。在綜合本團(tuán)隊(duì)及國外的最新研究進(jìn)展的基礎(chǔ)上，我們將以HSC的發(fā)育、維持、衰老及再生為研究的主線，以內(nèi)在調(diào)控機(jī)制和HSC微環(huán)境作為兩個(gè)重要的切入點(diǎn)，通過正向遺傳學(xué)及iPS細(xì)胞反向來源的HSC兩條途徑，對(duì)正常及衰老狀態(tài)下調(diào)控HSC命運(yùn)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)特別是關(guān)鍵分子靶點(diǎn)及網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行系統(tǒng)和全面的研究，并利用發(fā)育生物學(xué)的方法和技術(shù)加以驗(yàn)證和補(bǔ)充。其中正常及衰老狀態(tài)下HSC的維持與自我更新的調(diào)控機(jī)制是整個(gè)研究的核心和重點(diǎn)，將系統(tǒng)完整地闡釋HSC穩(wěn)態(tài)及衰老的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和關(guān)鍵的分子基礎(chǔ)。而對(duì)HSC的發(fā)育調(diào)控機(jī)制的研究，可以為整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的闡述提供重要的分子靶點(diǎn)及調(diào)控通路，彌補(bǔ)細(xì)胞水平上研究的不足，最終闡明HSC衰老與再生的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵分子基礎(chǔ)。在上述研究的基礎(chǔ)上，從調(diào)控HSC維持與分化的各個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)正常HSC及iPS細(xì)胞在體外擴(kuò)增及誘導(dǎo)分化的調(diào)控機(jī)制及策略進(jìn)行深入研究，服務(wù)于抗衰老及促進(jìn)組織再生的總目標(biāo)。（二）技術(shù)途徑：根據(jù)以上學(xué)術(shù)思路，以HSC的穩(wěn)態(tài)維持、衰老與再生的調(diào)控機(jī)制這一關(guān)鍵問題為出發(fā)點(diǎn)，從內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制及外源性調(diào)控機(jī)制兩個(gè)方面，通過正向遺傳學(xué)及iPS反向來源的HSC兩條通路，利用關(guān)鍵模式動(dòng)物，在分子水平上以p53-p21和p16-pRb兩條信號(hào)通路為核心，在細(xì)胞水平上以細(xì)胞周期調(diào)控及端粒為切入點(diǎn)，分別從成體HSC穩(wěn)態(tài)維持的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制；HSC衰老的關(guān)鍵分子及調(diào)控機(jī)制；HSC發(fā)育的調(diào)控機(jī)制；iPS為基礎(chǔ)的HSC再生新策略四個(gè)方面闡述HSC發(fā)育、維持、衰老及再生的完整調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及分子機(jī)制。上述四個(gè)方面的研究技術(shù)途徑如下所示：1、成體HSC穩(wěn)態(tài)維持的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制技術(shù)流程圖：

如圖所示對(duì)HSC穩(wěn)態(tài)維持的內(nèi)（p53通路和p16-pRb途徑）、夕卜（成骨細(xì)胞、MSC等造血干細(xì)胞微環(huán)境組成成分及其分泌因子）對(duì)HSC的穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控作用機(jī)制。具體方法如下：動(dòng)物模型（單基因敲除、雙基因敲除小鼠）的建立及繁育分離不同月齡模型小鼠的HSC后，研究HSC/HPC細(xì)胞周期的特點(diǎn)，并從細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的表達(dá)水平、功能等方面分析該模型HSC細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制與特點(diǎn)。利用流式細(xì)胞術(shù)分析HSC/HPC的免疫表型利用體外HSC的長周期培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、骨髓競爭移植實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)模型小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢的功能。用基因芯片比較基因單敲除、雙敲除小鼠及基因過表達(dá)小鼠和正常小鼠HSC基因表達(dá)的差異，并用實(shí)時(shí)定量PCR加以驗(yàn)證。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選擇1-2個(gè)目的基因進(jìn)行干預(yù)，觀察對(duì)HSC數(shù)目及功能的影響。2、HSC衰老的關(guān)鍵分子及調(diào)控機(jī)制技術(shù)路線:如圖所示，課題研究的主要技術(shù)途徑是以HSC衰老的兩個(gè)關(guān)鍵分子信號(hào)通路為核心，即端粒依賴的p53-p21途徑和端粒非依賴的p16-pRb途徑。Terc-/-小鼠的HSC在衰老過程中端粒持續(xù)縮短，通過激活p53-p21途徑引起HSC的衰老。另夕卜，ATM-/-小鼠的HSC中內(nèi)源性ROS升高，激活p38依賴的p16衰老途徑,導(dǎo)致HSC的自我更新能力下降。GADD45a基因在維持基因組的穩(wěn)定性、細(xì)胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、調(diào)控細(xì)胞衰老及凋亡等方面起著重要作用。當(dāng)細(xì)胞受到各種損傷應(yīng)激時(shí)，在p53或者p38介導(dǎo)下，GADD45a直接參與細(xì)胞周期的調(diào)控。課題的第一部分主要研究端?？s短或者ROS升高是否通過GADD45a基因調(diào)控HSC的自我更新和穩(wěn)態(tài)維持。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，放射線照射引起HSC中慢性氧化應(yīng)激導(dǎo)致HSC衰老，其中N0X4是介導(dǎo)HSC中ROS升高的重要原因。課題的第二部分主要探討端粒縮短或者ATM基因缺失是否通過N0X4基因上調(diào)HSC內(nèi)源性ROS水平。3、HSC發(fā)育的調(diào)控機(jī)制技術(shù)路線：如圖所示，本課題首先通過斑馬魚和小鼠2種手段發(fā)掘潛在的調(diào)節(jié)分子。通過對(duì)已有的HSC發(fā)育突變家系進(jìn)行定位克隆，識(shí)別2-6個(gè)關(guān)鍵“節(jié)點(diǎn)”基因；或者,建立Flk-1p/e報(bào)告載體，利用小鼠體內(nèi)和體外細(xì)胞模型分別篩選與內(nèi)皮細(xì)胞造血功能有關(guān)的調(diào)控分子。繼而，從發(fā)育新位點(diǎn)、起源模式及表面分子特征3個(gè)方面研究小鼠胚胎HSC的發(fā)育特點(diǎn)，應(yīng)用T/B細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化、HSC移植等手段；采用胚胎發(fā)育中僅在特定內(nèi)皮細(xì)胞群體中表達(dá)的分子如Endomucin和EphB4的啟動(dòng)子，構(gòu)建組成型或可誘導(dǎo)型的在特定內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)譜系示蹤，了解這些特定的內(nèi)皮群體生理?xiàng)l件下對(duì)HSC的貢獻(xiàn)，并為實(shí)現(xiàn)生血內(nèi)皮水平的特定基因敲除奠定基礎(chǔ)。最后，基于已有的基因敲除小鼠；或者選取前述篩選獲得的若干候選基因，應(yīng)用小鼠胚胎干細(xì)胞和胚胎AGM區(qū)細(xì)胞的基因過表達(dá)/敲減、以及基因敲除小鼠等技術(shù)手段，通過分析造血相關(guān)基因表達(dá)、不同造血前體（血液血管干細(xì)胞、生血內(nèi)皮細(xì)胞、HSC）的數(shù)量及功能評(píng)價(jià)它們?cè)谛∈笈咛ピ煅l(fā)育中的重要意義。4、iPS細(xì)胞為基礎(chǔ)的HSC再生新策略技術(shù)路線：如圖所示：從不同年齡段的人外周血或骨髓中獲得HSC，分析HSC中p53,p16以及DNA甲基化等特征。并誘導(dǎo)其重編程為iPS細(xì)胞，進(jìn)行表型與全能性鑒定，在此基礎(chǔ)上比較不同年齡段HSC生成iPS細(xì)胞能力是否不同。進(jìn)一步以不同來源iPS細(xì)胞為起始細(xì)胞，定向誘導(dǎo)其向造血細(xì)胞乃至紅系細(xì)胞分化，比較不同來源的iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的能力。與此同時(shí)，對(duì)iPS細(xì)胞向HSC尤其是紅系祖細(xì)胞定向分化的機(jī)制進(jìn)行探討，側(cè)重研究Wnt3a、PGE2等分子的調(diào)控作用。（三）創(chuàng)新點(diǎn)與特色1、首次研究p53、Rb和端粒等重要信號(hào)通路中的關(guān)鍵分子環(huán)節(jié)中Puma、GADD45a、p21、p18、ATF4和N0X4等一系列重要相關(guān)分子在組織干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)維持和衰老中的獨(dú)特作用及其相互關(guān)系,并進(jìn)一步利用發(fā)育模式生物尋找若干新的與組織再生緊密相關(guān)的分子靶點(diǎn)。因而本項(xiàng)目的科學(xué)問題具體明確，有很強(qiáng)的創(chuàng)新性。2、圍繞HSC的調(diào)控這一重點(diǎn)，以其內(nèi)在機(jī)制和微環(huán)境作為兩個(gè)重要的切入點(diǎn)，通過正向遺傳學(xué)及iPS細(xì)胞反向來源的HSC兩條技術(shù)路經(jīng)，在國家重大研究計(jì)劃中第一次對(duì)調(diào)控HSC命運(yùn)的網(wǎng)絡(luò)及關(guān)鍵分子靶點(diǎn)進(jìn)行系統(tǒng)和全面的研究，從而彌補(bǔ)我國在此領(lǐng)域的空白。3、鑒于HSC是研究歷史長、表型較清楚、最早報(bào)道與整體衰老相關(guān)且臨床治療效果得以公認(rèn)的一類組織干細(xì)胞，研究結(jié)果不僅對(duì)研究其它組織干細(xì)胞在機(jī)體衰老再生中的作用有著無法取代的范式作用，而且具有直接的臨床指導(dǎo)價(jià)值。因而本項(xiàng)目研究重點(diǎn)十分突出和必要，有很大的潛在社會(huì)效益。4、參加人員已在相關(guān)領(lǐng)域已得到國際認(rèn)可或領(lǐng)先的前期研究結(jié)果。本研究課題所涉及的各個(gè)方面內(nèi)容大多是在以往工作基礎(chǔ)上的進(jìn)一步延伸或拓展，但又與前期工作無重復(fù)。因而本項(xiàng)目具有很高的研究起點(diǎn)和可行性。預(yù)期結(jié)果必將在國際上占領(lǐng)HSC研究領(lǐng)域中的新高地，促進(jìn)我國干細(xì)胞研究整體水平和地位的進(jìn)一步提升。5、研究團(tuán)隊(duì)整合了目前國內(nèi)從事HSC生物學(xué)和應(yīng)用基礎(chǔ)研究的最優(yōu)秀的力量。其中大部分骨干已有成功合作的基礎(chǔ)、成果或正在合作，課題設(shè)臵充分體現(xiàn)青年研究人員的骨干作用，因而本團(tuán)隊(duì)是一個(gè)有機(jī)整合、布局合理、充滿活力，有著很強(qiáng)競爭力和創(chuàng)新力的研究隊(duì)伍。（四）可行性分析1、前期工作基礎(chǔ)1）團(tuán)隊(duì)內(nèi)前期取得了大量研究成果，本項(xiàng)目是對(duì)這些原創(chuàng)性研究的進(jìn)一步深化、整合及轉(zhuǎn)化，保證了研究方案的順利執(zhí)行及預(yù)期目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。2）團(tuán)隊(duì)內(nèi)已經(jīng)開展的廣泛深入的合作（共同申請(qǐng)了課題及共同發(fā)表了相應(yīng)的高水平的文章）為項(xiàng)目順利進(jìn)行奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，可使各課題間的有機(jī)、密切的聯(lián)系得以實(shí)現(xiàn)。2、學(xué)術(shù)隊(duì)伍：1）高水平的學(xué)術(shù)帶頭人保證了項(xiàng)目研究方向的前瞻性、準(zhǔn)確性及研究方案的可行性，科學(xué)性。項(xiàng)目推薦首席科學(xué)家程濤教授為長江學(xué)者特聘教授、國家杰出青年基金獲得者、并于2008年任實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室主任。作為知名的干細(xì)胞生物學(xué)家，曾在美國作為課題負(fù)責(zé)人獲得多項(xiàng)NIH等機(jī)構(gòu)的基金資助并多次參加NIH干細(xì)胞項(xiàng)目評(píng)審。多次領(lǐng)銜天津市干細(xì)胞研究重大項(xiàng)目和負(fù)責(zé)科技部國家級(jí)科研項(xiàng)目，掌握干細(xì)胞生物學(xué)研究的國際動(dòng)態(tài)和發(fā)展趨勢，多次舉辦過規(guī)模不等的國內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會(huì)或講習(xí)班，具有較強(qiáng)科研組織協(xié)調(diào)能力，從而本項(xiàng)目的執(zhí)行打下必要的基礎(chǔ)。其它課題負(fù)責(zé)人或是相關(guān)研究領(lǐng)域的優(yōu)秀學(xué)科帶頭人或是在國際上有相當(dāng)影響力的海外回國人員。這些特點(diǎn)將有利于保證項(xiàng)目的順利完成。2）結(jié)構(gòu)合理的優(yōu)秀科研團(tuán)隊(duì)保證了研究方案的順利實(shí)施：團(tuán)隊(duì)匯集了國內(nèi)造血干細(xì)胞研究領(lǐng)域的領(lǐng)軍人物，包括了多名長江學(xué)者、國家杰出青年、百人計(jì)劃、北京市科技新星等優(yōu)秀科研人才，長期從事HSC生物學(xué)方面的研究，尤其在HSC細(xì)胞周期調(diào)控、p53下游基因、端粒酶、HSC發(fā)生、發(fā)育及iPS等方面做出了一系列原創(chuàng)性并具有國際領(lǐng)先性的研究工作。在國際頂尖雜志（Science,Nature,NatureGenetics,NatureMedicine,NatureCellBiology,Cell,CellStemCell,PNAS,Blood,StemCells等）上發(fā)表過造血干細(xì)胞相關(guān)的學(xué)術(shù)論文50余篇（第一作者及通訊作者），掌握項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)涉及的全部先進(jìn)技術(shù)，具備良好的實(shí)施大型科研項(xiàng)目的能力，保證了項(xiàng)目的實(shí)施及技術(shù)問題的解決。3、實(shí)驗(yàn)平臺(tái)：本項(xiàng)目參加單位有國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3個(gè)，衛(wèi)生部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1個(gè),全軍重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室1個(gè)，重點(diǎn)學(xué)科6個(gè)。實(shí)驗(yàn)室設(shè)備先進(jìn)，技術(shù)力量雄厚，保證了實(shí)驗(yàn)需要的所有技術(shù)平臺(tái)、實(shí)驗(yàn)技術(shù)在國內(nèi)、外均處于領(lǐng)先水平。（四）課題設(shè)臵各課題間相互關(guān)系以本團(tuán)隊(duì)的大量前期工作為基礎(chǔ)，結(jié)合國內(nèi)外最新研究進(jìn)展設(shè)置4個(gè)課題:1、成體HSC穩(wěn)態(tài)維持的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制；2、HSC衰老的關(guān)鍵分子及調(diào)控機(jī)制；3、HSC發(fā)育的調(diào)控機(jī)制;4、iPS細(xì)胞為基礎(chǔ)的HSC再生新策略?本項(xiàng)目的四個(gè)課題均圍繞HSC的維持、衰老與再生的調(diào)控機(jī)制這一關(guān)鍵科學(xué)問題進(jìn)行研究，各課題組既有明確的研究方向，又有密切的聯(lián)系。而且課題組成員已在上述領(lǐng)域進(jìn)行了長期的原創(chuàng)性研究，成員間已有多年合作研究的基礎(chǔ)和成果（見后述）課題一、二是整個(gè)研究的核心和重點(diǎn)，旨在闡明HSC的穩(wěn)態(tài)及衰老的整體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。課題三的研究利用發(fā)育生物學(xué)的方法和技術(shù)不僅對(duì)核心研究提出的重要的分子靶點(diǎn)及調(diào)控通路進(jìn)行驗(yàn)證，而且為整個(gè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的闡釋加以補(bǔ)充，彌補(bǔ)了分子及細(xì)胞水平研究上的不足。課題四是在上述研究的基礎(chǔ)上，為HSC及iPS細(xì)胞的體外高效、安全的擴(kuò)增及定向分化提供理論依據(jù)，提出最終策略。課題一至三，共同為課題四提供理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，而課題四是在其它課題研究的基礎(chǔ)上，研究成果服務(wù)于對(duì)抗衰老、促進(jìn)再生的整體目標(biāo)，為課題一至三提供調(diào)控臨床應(yīng)用的最終落腳點(diǎn)。捉供分子基礎(chǔ)及調(diào)控機(jī)制提出新策略提出新策略課題一：成體HSC穩(wěn)態(tài)維持的內(nèi)外調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo):1、利用本團(tuán)隊(duì)已建立的基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠模型探討Puma、iASPP等p53通路相關(guān)基因?qū)SC的穩(wěn)態(tài)維持及分化潛能調(diào)控的作用機(jī)制。2、利用已建立的基因單敲除、雙敲除小鼠模型探討p16、p18等p16-pRb途徑相關(guān)基因?qū)τ资?、成年鼠及衰老小鼠HSC的數(shù)目及穩(wěn)態(tài)維持等功能的調(diào)控作用及調(diào)控機(jī)制。3、利用ATF-/-小鼠及骨髓MSC數(shù)量減少或功能缺失的小鼠模型，探討成骨細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞巢組成成分及其分泌因子對(duì)HSC的穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控作用機(jī)制。研究內(nèi)容:1、Puma基因?qū)SC的自我更新和穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控作用程濤課題組已經(jīng)引進(jìn)了Puma基因敲除的小鼠模型并已將其回交到純系小鼠C57BL/6的遺傳背景上。在此基礎(chǔ)上,擬進(jìn)行以下內(nèi)容的研究.利用流式細(xì)胞術(shù)分析在Puma基因敲除的小鼠模型中，幼鼠、成年鼠及衰老小鼠HSC的免疫表型及數(shù)目、HSC的細(xì)胞周期及CKI蛋白的表達(dá)情況。利用Puma基因敲除的小鼠模型，通過競爭性骨髓移植實(shí)驗(yàn)方法分析Puma缺失對(duì)不同階段的小鼠造血干細(xì)胞的功能，特別是自我更新的能力的影響。分離Puma基因敲除小鼠的HSC,在體外利用單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)HSC的增值動(dòng)力學(xué)及分化潛能進(jìn)行分析。D．根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，采取干擾的方法降低正常干細(xì)胞Puma基因的表達(dá)水平，再進(jìn)行HSC連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)HSC移植率的影響。采取競爭移植方法觀察降低Puma基因表達(dá)對(duì)重建造血的影響。2、iASPP基因?qū)SC的自我更新和穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控機(jī)制研究A．iASPP對(duì)HSC抗凋亡、衰老作用研究1）iASPP轉(zhuǎn)基因小鼠及l(fā)ittermatecontrol小鼠，分別接受3Gy照射，照射后6小時(shí)和24小時(shí)，取骨髓，使用流式細(xì)胞儀分析HSC/HPC凋亡、衰老情況，進(jìn)行H2AX抗體染色，分析DNA斷裂數(shù)量。2）連續(xù)HSC移植。iASPP轉(zhuǎn)基因小鼠及l(fā)ittermatecontrol小鼠，取骨髓細(xì)胞，移植入致死劑量照射的同系小鼠中。造血重建后，再次取受體小鼠骨髓細(xì)胞進(jìn)行下一輪HSC移植，依次重復(fù)。經(jīng)過這些研究可以明確iASPP是否會(huì)抑制造血干細(xì)胞受到DNA損傷后的凋亡、衰老，有助于HSC的存活，使受到損傷的HSC積累更多的突變，促進(jìn)衰老的發(fā)生。iASPP在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用根據(jù)免疫表型分析iASPP轉(zhuǎn)基因小鼠HSC和HPC的比例和數(shù)量及競爭移植實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)iASPP在造血干細(xì)胞自我更新、多向分化和增殖中的作用。C、iASPP在HSC歸巢中的作用體外歸巢能力評(píng)價(jià):取iASPP轉(zhuǎn)基因小鼠及l(fā)ittermatecontrol小鼠的lin-c-kit+Sca-1+造血細(xì)胞進(jìn)行transwell實(shí)驗(yàn)，體外評(píng)價(jià)iASPP對(duì)HSC歸巢能力的影響。3、p16-pRb對(duì)HSC維持、衰老及再生的調(diào)控機(jī)制研究前期研究發(fā)現(xiàn)，此通路中的p16及p19在連續(xù)移植的小鼠細(xì)胞中（〉30個(gè)月）高表達(dá)，而僅幾輪骨髓移植后,p16-/-組HSC的自我更新能力和對(duì)照組沒有差別，提示在小鼠衰老過程發(fā)生前,p16并不是一個(gè)敏感的生物標(biāo)記?而p21在靜息態(tài)的HSC高表達(dá)，所以在HSC的衰老中不起必須性的作用。但p21-/-小鼠HSC大量進(jìn)入增殖周期，絕對(duì)數(shù)量增加，這和造血系統(tǒng)衰老時(shí)HSC的表現(xiàn)類似，而且在反復(fù)移植壓力下，最終受體小鼠亦出現(xiàn)了造血功能衰竭。而p18的敲除或抑制可以逆轉(zhuǎn)由于p21缺乏導(dǎo)致的造血衰竭現(xiàn)象。由此我們推測p21和p18有可能是作用相反的兩個(gè)開關(guān)，在HSC衰老及再生的過程中共同調(diào)節(jié)HSC的數(shù)目及功能，為了驗(yàn)證這一假設(shè)，擬進(jìn)行以下內(nèi)容的研究。利用realtime-PCR及westernblot分別在RNA及蛋白水平檢測幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的p18/p21的比例及p16p19的水平。利用體外HSC的長周期培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、骨髓競爭移植實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)p18-/-或p21-/-的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢的功能用基因芯片技術(shù)對(duì)不同CKI單基因及雙基因敲除模型的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析4、ATF-4對(duì)HSC維持、衰老及再生的調(diào)控機(jī)制研究課題組已經(jīng)建立了ATF—4基因敲除小鼠模型。利用該模式動(dòng)物擬進(jìn)行以下內(nèi)容研究，最終闡ATF-4對(duì)HSC維持、衰老及再生的調(diào)控機(jī)制分離ATF-4-/-小鼠的HSC后，研究HSC/HPC細(xì)胞周期的特點(diǎn)，并從細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的水平、功能等方面研究該模型HSC細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制與特點(diǎn)。B?利用體外HSC的長周期培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、骨髓競爭移植實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)ATF-4-/-小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢的功能。C?用基因芯片比較ATF-4-/-小鼠和正常小鼠HSC基因表達(dá)的差異，并用實(shí)時(shí)定量PCR加以驗(yàn)證。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選擇1-2個(gè)目的基因進(jìn)行干預(yù)，觀察對(duì)HSC數(shù)目及功能的影響。5、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)對(duì)HSC維持、分化及衰老的調(diào)控作用機(jī)制建立骨髓MSC數(shù)量減少或功能缺失的動(dòng)物模型。MSC表達(dá)多種表面分子，其中HOP-26(CD63)、CD49a和SB-10(CD166)可以作為MSC的標(biāo)志。分別建立HOP-26、CD49a或SB-10單基因或雙基因缺陷小鼠，然后分別研究它們骨髓MSC改變的情況，篩選出最佳的骨髓MSC數(shù)量減少或功能缺失的動(dòng)物模型。研究MSC數(shù)量減少或功能缺失導(dǎo)致的HSC以及成熟血細(xì)胞的變化。收集基因缺陷小鼠的骨髓細(xì)胞和外周血，流式細(xì)胞儀檢測造血干/祖細(xì)胞以及淋巴細(xì)胞系、髓系、紅系等細(xì)胞的比例，分離干/祖細(xì)胞研究其集落形成能力及造血重建能力。研究同基因和異基因HSC和MSC共移植模型治療骨髓衰竭的作用。將同基因和異基因HSC和MSC單移植和共移植至致死量和亞致死量輻射動(dòng)物體內(nèi)，觀察這兩種干細(xì)胞移植對(duì)動(dòng)物輻射損傷后的不同治療作用，重點(diǎn)探討MSC移植在重建造血及其微環(huán)境中的作用及其機(jī)制。經(jīng)費(fèi)比例:30%承擔(dān)單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）課題負(fù)責(zé)人:程濤學(xué)術(shù)骨干:王敏，袁衛(wèi)平,高瀛岱課題二：HSC衰老的關(guān)鍵分子及調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo):課題總的研究目標(biāo)是利用基因敲除小鼠模型研究HSC衰老的關(guān)鍵分子信號(hào)通路及其調(diào)控機(jī)制。具體的研究目標(biāo)包括：在端?？s短或者ROS升高情況下，研究HSC的自我更新和穩(wěn)態(tài)維持的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)；探討衰老和損傷應(yīng)激狀態(tài)下，HSC中內(nèi)源性ROS產(chǎn)生機(jī)制及其對(duì)HSC自我更新能力的影響；研究內(nèi)容:1、在端?？s短或者ROS升高情況下，研究GADD45a基因?qū)SC衰老的調(diào)控。G3Terc-/-小鼠HSC的衰老主要是由于端粒依賴的p53途徑，而ATM-/-小鼠HSC的衰老主要是由于端粒非依賴的p38途徑。在不同損傷應(yīng)激情況下，GADD45a基因參與p53或者p38介導(dǎo)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。我們將通過建立Terc和GADD45a雙基因敲除小鼠，以及ATM和GADD45a雙基因敲除小鼠，分別研究端?？s短或者ROS升高導(dǎo)致的HSC衰老過程中GADD45a基因的作用。具體研究內(nèi)容如下：（1）通過雜交的方式，建立兩種雙基因敲除小鼠品系。其中，Terc和GADD45a雙基因敲除小鼠需要通過連續(xù)雜交方式，產(chǎn)生第三代的Terc和GADD45a雙基因敲除小鼠（G3Terc-/-GADD45a-/-）。（2）建立并維持Terc+/+GADD45a+/+，G3Terc-/-GADD45a+/+，Terc+/+GADD45a-/-，G3Terc-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠種群；建立并維持ATM+/+GADD45a+/+，ATM-/-GADD45a+/+，ATM+/+GADD45a-/-，ATM-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠種群。（3）記錄小鼠的體重、活動(dòng)能力、外周血計(jì)數(shù)和生存時(shí)間，分析各種基因型小鼠的生存曲線。（4）通過流式細(xì)胞術(shù)分析各種基因型小鼠造血系統(tǒng)的衰老表現(xiàn)以及造血干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持。（5）通過競爭性HSC移植實(shí)驗(yàn)，分析各種基因型小鼠HSC自我更新能力和分化潛能的改變。（6）將野生型小鼠HSC移植入各種基因型小鼠體內(nèi)，研究干細(xì)胞環(huán)境的改變對(duì)正常HSC自我更新能力和分化潛能的影響。2、探討衰老及應(yīng)激狀態(tài)下HSC中ROS產(chǎn)生機(jī)制及其對(duì)HSC自我更新能力的影響，闡明HSC細(xì)胞衰老的氧化損傷機(jī)制。具體研究內(nèi)容如下：（1）利用端粒酶、ATM缺失小鼠，觀察老年小鼠HSC中ROS升高是否伴隨有N0X4的高表達(dá)。利用N0X4抑制劑或RNA干擾技術(shù)抑制N0X4表達(dá)對(duì)老年小鼠HSC的自我更新能力及ROS升高是否具有改善作用。（2）利用端粒酶、ATM缺失小鼠在DNA損傷應(yīng)激刺激時(shí)（不同劑量全身照射及DNA損傷誘導(dǎo)劑），HSC中N0X4表達(dá)及與HSC功能改變的關(guān)系。（3）利用NOX4缺陷小鼠與端粒酶缺陷小鼠或ATM缺陷小鼠雙敲除，進(jìn)一步探討N0X4產(chǎn)生的ROS在HSC衰老中的意義。（4）分析測定老年小鼠及氧應(yīng)激暴露小鼠（照射或DNA損傷藥物）HSC中DNA雙鏈斷裂損傷及由ROS誘導(dǎo)的DNA損傷產(chǎn)物羥基-2'脫氧鳥嘌呤核苷（8-OH-dG）含量與HSC功能損傷的關(guān)系。（5）利用不同模式動(dòng)物的模型以及通路蛋白抑制劑闡明ATM等DNA反應(yīng)蛋白對(duì)NOX來源的ROS的調(diào)節(jié)作用。（6）利用不同模式動(dòng)物的模型以及通路蛋白抑制劑闡明NOX來源的ROS對(duì)HSC細(xì)胞周期調(diào)控的影響包括與p53/p21、p38/p16信號(hào)通路蛋白調(diào)節(jié)的相關(guān)關(guān)系。經(jīng)費(fèi)比例:24%承擔(dān)單位:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（血液學(xué)研究所）課題負(fù)責(zé)人:鞠振宇學(xué)術(shù)骨干:韓忠朝，鄭以州，孟愛民課題三：HSC發(fā)育的調(diào)控機(jī)制研究目標(biāo)：通過ENU化學(xué)誘變和全胚胎原位技術(shù)在全基因組規(guī)模篩選影響HSC增殖,遷移和自我更新的斑馬魚突變家系，并對(duì)相關(guān)家系進(jìn)行定位克隆，識(shí)別2-6個(gè)參與HSC發(fā)育的關(guān)鍵“節(jié)點(diǎn)”基因，聯(lián)合小鼠模式生物闡明候選基因在小鼠胚胎HSC發(fā)生中的調(diào)控作用及機(jī)理；發(fā)掘小鼠胚內(nèi)HSC發(fā)育的新位點(diǎn)，闡明血液血管干細(xì)胞產(chǎn)生HSC的潛能，并獲得提高胚胎期HSC富集效率的表面分子新組合;通過制備1-2種組成型和誘導(dǎo)型在特定內(nèi)皮細(xì)胞群體中表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，闡明不同解剖位點(diǎn)對(duì)成體造血的生理性貢獻(xiàn)；闡明TGF-D/Smads、p53通路、CKI對(duì)胚胎AGM區(qū)定向造血（尤其是HSC）的調(diào)控作用及機(jī)制。研究內(nèi)容：1、調(diào)控HSC發(fā)生的功能基因的基礎(chǔ)篩選（1）利用斑馬魚模型發(fā)掘HSC發(fā)生的新型調(diào)控分子1）基于前期工作中已通過Runx1和c-myb基因探針原位雜交證實(shí)的造血干細(xì)胞突變家系，逐步利用多態(tài)性markers，將候選疾病基因定位于1/2000，即0.05個(gè)cM分辨率內(nèi)。2）克隆該候選基因并測序證實(shí)突變的存在，初步評(píng)估其對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響（如移碼突變）；而后經(jīng)過基因敲減和Rescue技術(shù)證實(shí)該突變基因?yàn)楹蜻x基因。3）已克隆的基因有三種情況：a）已知基因和已知功能（參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑已知）；b）已知基因但未知功能；c）未知基因和未知功能。第一種情況將已知的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和造血干細(xì)胞遷移或自我更新表型相連。第二，三種情況需要對(duì)被克隆的基因進(jìn)行功能和生化機(jī)制分析。（2）基于小鼠Flk-1啟動(dòng)子/增強(qiáng)子活性的HSC調(diào)節(jié)基因篩選構(gòu)建Flk-lp/eGFP報(bào)告載體，制備轉(zhuǎn)基因小鼠，分選AGM區(qū)PECAM-1+GFP-（生血內(nèi)皮）和PECAM-1+GFP+（非生血內(nèi)皮）細(xì)胞，進(jìn)行功能基因組生物芯片比較分析；或者制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flk-lp/eGFP的內(nèi)皮細(xì)胞系（無生血功能），通過cDNA表達(dá)文庫和RNAi文庫轉(zhuǎn)染獲得GFP-細(xì)胞克?。ê蜻x的生血內(nèi)皮細(xì)胞）；即可通過上述2種方法獲得候選的調(diào)節(jié)基因。2、小鼠HSC發(fā)生的基本特征和體內(nèi)示蹤（1）HSC的發(fā)育位點(diǎn)、起源模式和表面標(biāo)志）小鼠胚內(nèi)（E8.5-E10.5）造血位點(diǎn)的全面分析應(yīng)用新生小鼠及改進(jìn)的成體小鼠HSC移植模型、T/B淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化系統(tǒng)等方法綜合分析胚內(nèi)（除p-Sp/AGM區(qū)外）的造血活性；通過體外器官培養(yǎng)、Ncx-1基因敲除小鼠（胚胎無血液循環(huán)）進(jìn)一步明確其造血潛能是否原位發(fā)生？）小鼠AGM區(qū)血液血管干細(xì)胞的HSC潛能分析在前期工作基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確AGM區(qū)血液血管干細(xì)胞（BL-CFC）的表面分子特征，候選分子包括SLAM（CD150/CD48）、Flt3、CD41、ESAM等；結(jié)合上述結(jié)果，流式多參數(shù)分選小鼠E10.5胚胎AGM區(qū)（如：Flk-1+CD34+c-Kit+）單細(xì)胞單孔接種于雙潛能分化體系，之后收集分化細(xì)胞分別作血管和HSC功能分析，以明確血液血管干細(xì)胞可否是HSC的前體。）小鼠AGM區(qū)HSC的新的表面分子的發(fā)掘通過分選獲得AGM區(qū)E10.5的Tie2+c-Kit+（具有生血功能的內(nèi)皮細(xì)胞）和Tie2+c-Kit-（缺乏生血功能的內(nèi)皮細(xì)胞），通過生物芯片分析獲得差異表達(dá)基因（以表面分子為主）；上述篩選的候選分子與已知標(biāo)志結(jié)合，進(jìn)一步分選以提高AGM區(qū)HSC的富集效率；檢測上述分子是否適用于卵黃囊、胎盤、胎肝、骨髓等造血組織HSC的甄別。（2）利用模式小鼠示蹤HSC的體內(nèi)發(fā)生規(guī)律采用胚胎發(fā)育中僅在特定內(nèi)皮細(xì)胞群體中表達(dá)的分子如Endomucin（除了胚胎體的血管內(nèi)皮，僅表達(dá)于卵黃囊的部分內(nèi)皮細(xì)胞）和EphB4（靜脈內(nèi)皮特異表達(dá)）的啟動(dòng)子，構(gòu)建組成型或可誘導(dǎo)型的在特定內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)譜系示蹤，了解這些特定的內(nèi)皮群體生理?xiàng)l件下對(duì)HSC的貢獻(xiàn)，豐富和完善對(duì)生血內(nèi)皮特征的認(rèn)識(shí)；之后，結(jié)合已有的條件基因敲除小鼠模型，研究在內(nèi)皮細(xì)胞中剔除TGF-p/Smads通路中信號(hào)分子（如TGF-Dreceptortype2,Smad4）、P53相關(guān)分子、多種CKI等的小鼠其生血內(nèi)皮的數(shù)量、功能以及定向造血發(fā)育是否異常，并進(jìn)一步探索可能的分子調(diào)節(jié)機(jī)制。3、系統(tǒng)研究候選新基因?qū)π∈驢SC發(fā)生的調(diào)節(jié)功能應(yīng)用已有的基因敲除或過表達(dá)的小鼠模型，通過血液血管干細(xì)胞定量、生血內(nèi)皮功能及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、競爭移植實(shí)驗(yàn)等方法探討Puma、iASPP等p53通路相關(guān)基因及p18等細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制劑（CKI）對(duì)胚胎AGM區(qū)定向造血（尤其是HSC的數(shù)目和功能）的調(diào)控作用及機(jī)制。選取前述斑馬魚及小鼠模型篩選獲得的若干候選基因，制備基因過表達(dá)和敲減載體，分別感染小鼠胚胎干細(xì)胞和胚胎AGM區(qū)細(xì)胞，通過分析造血相關(guān)基因表達(dá)、血液血管干細(xì)胞數(shù)量及功能、生血內(nèi)皮數(shù)量及功能、HSC數(shù)量及功能等指標(biāo)以評(píng)價(jià)該基因在小鼠胚胎造血發(fā)育中的意義；若需要，可制備基因敲除小鼠作更詳細(xì)分析。經(jīng)費(fèi)比例:24%承擔(dān)單位:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院、中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院課題負(fù)責(zé)人:劉兵學(xué)術(shù)骨干:劉廷析、鄧敏、蘭雨課題四：iPS細(xì)胞為基礎(chǔ)的HSC再生新策略研究目標(biāo):1、從不同衰老程度的臍帶血HSC、中年人骨髓或外周血造血干HSC、老年人骨髓或外周血HSC誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞，并定向誘導(dǎo)其向造血細(xì)胞分化，通過比較不同細(xì)胞來源iPS細(xì)胞生成能力以及iPS細(xì)胞定向分化能力等差別，確定不同衰老程度的HSC與iPS細(xì)胞生成的關(guān)系及探討可能的機(jī)制；2、對(duì)iPS細(xì)胞向HSC尤其是紅系祖細(xì)胞定向分化的機(jī)制進(jìn)行探討，側(cè)重研究微環(huán)境中的信號(hào)分子對(duì)iPS細(xì)胞向HSC尤其是紅系祖細(xì)胞分化的影響，分析其可能的調(diào)控機(jī)制。3、進(jìn)一步優(yōu)化iPS細(xì)胞向HSC尤其是紅系祖細(xì)定向分化的條件，為全面推動(dòng)iPS細(xì)胞來源的HSC或紅系祖細(xì)胞走向臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。研究內(nèi)容從不同年齡段的人外周血或骨髓中獲得HSC,誘導(dǎo)獲得iPS細(xì)胞，探討不同年齡的人HSC形成iPS細(xì)胞的能力；并在此研究基礎(chǔ)上定向誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞分化，比較不同HSC來源的iPS細(xì)胞再生造血系統(tǒng)的能力；與此同時(shí)，結(jié)合課題其它幾個(gè)部分的研究結(jié)果，分析p53、p16等遺傳學(xué)因素和DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)因素在iPS細(xì)胞生成和分化中的作用和調(diào)控機(jī)制。進(jìn)一步優(yōu)化iPS細(xì)胞向造血細(xì)胞分化的條件，為以iPS細(xì)胞為起始細(xì)胞的HSC再生打下基礎(chǔ)。具體研究內(nèi)容包括三個(gè)部分：1、建立不同年齡段人HSC來源的iPS細(xì)胞系，分析其生成iPS細(xì)胞能力是否有差別分選獲得不同年齡段（新生兒的臍帶血、20-30歲人骨髓或外周血、60-70歲人骨髓或外周血）人HSC，并利用SCF等細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，結(jié)合前幾個(gè)部分的研究內(nèi)容，分析不同來源的HSC中p53,p16通路中關(guān)鍵因子表達(dá)以及DNA甲基化等表達(dá)遺傳學(xué)特征。誘導(dǎo)HSC形成iPS細(xì)胞，通過堿磷酶染色、實(shí)時(shí)定量PCR、WesternBlot、基因芯片等方法檢測這些細(xì)胞的重編程的效率、全能性相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)情況,體內(nèi)外分化實(shí)驗(yàn)檢測iPS細(xì)胞是否具有分化的全能性。觀察不同來源細(xì)胞所形成iPS細(xì)胞的能力是否有差異。分析p16、p53等衰老相關(guān)基因以及DAN甲基化等表觀遺傳學(xué)因素在HSC形成iPS細(xì)胞的過程中可能的作用。與此同時(shí)，結(jié)合第二部分的研究工作，研究不同年齡階段的端粒酶敲除小鼠或者ATM基因敲除小鼠的鼠尾成纖維細(xì)胞（TTFs）在體外誘導(dǎo)生成iPS細(xì)胞的效率。2、iPS細(xì)胞向HSC定向誘導(dǎo)分化首先在無血清培養(yǎng)體系下利用細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向HSC/HPC的誘導(dǎo)，然后對(duì)誘導(dǎo)獲得的造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行分選富集與鑒定，并在此基礎(chǔ)上特異性誘導(dǎo)造血干/祖細(xì)胞定向分化為紅系細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)分化的紅系細(xì)胞的表型和功能進(jìn)行檢測。在上述誘導(dǎo)分化模型建立的基礎(chǔ)上比較不同衰老程度的HSC誘導(dǎo)生成的iPS細(xì)胞向HSC及紅細(xì)胞分化的效率。3、iPS細(xì)胞形成與向HSC定向分化的機(jī)制研究結(jié)合課題其它幾個(gè)部分的研究結(jié)果，探討p53、p16等遺傳學(xué)因素和DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)因素在iPS細(xì)胞生成和分化中的作用和調(diào)控機(jī)制，并篩選鑒定不同衰老程度的HSC中可能影響iPS細(xì)胞生成和分化的因素并明確其作用；與此同時(shí)研究Wnt3a、PGE2等關(guān)鍵信號(hào)分子對(duì)ES/iPS細(xì)胞向HSC定向分化的影響，分析其可能調(diào)節(jié)的信號(hào)通路。經(jīng)費(fèi)比例:22%承擔(dān)單位:軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，北京生命科學(xué)研究所，北京大學(xué)課題負(fù)責(zé)人:岳文學(xué)術(shù)骨干:高紹榮時(shí)艷李艷華四、年度計(jì)劃年度1、研究內(nèi)容（1）利用流式細(xì)胞術(shù)分析在Puma、iASPP基因敲除的小鼠模型中，幼鼠、成年鼠及衰老小鼠HSC的免疫表型及數(shù)目、HSC的細(xì)胞周期及CKI蛋白的表達(dá)情況利用realtime-PCR及westernblot分別在RNA及蛋白水平檢測幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的pl8/p21的比例及p16p19的水平。（2）建立兩種雙基因敲除小鼠品系。Terc和GADD45a雙基因敲除小鼠需要通過連續(xù)傳代的方式，產(chǎn)生第三代的Terc和GADD45a雙基因敲除小鼠（G3Terc-/-GADD45a-/-）建立并維持Terc+/+GADD45a+/+,G3Terc-/-GADD45a+/+,Terc+/+GADD45a-/-，G3Terc-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠的研究隊(duì)列。建立并維持ATM+/+GADD45a+/+，ATM-/-GADD45a+/+，ATM+/+GADD45a-/-，ATM-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠的研究隊(duì)列。（3）完成對(duì)ENU（N-乙基-N-硝基脲）化學(xué)誘變處理后的斑馬魚F2代突變遺傳家系800個(gè)的收集工作和大約10萬份全胚胎原位雜交篩選；（4）應(yīng)用改進(jìn)的成體和新生小鼠HSC移植模型、T/B淋巴細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化等方法綜合分析胚內(nèi)（除p-Sp/AGM區(qū)外）的造血活性分布特點(diǎn)；考察若干表面標(biāo)志基因在AGM區(qū)HSC發(fā)育過程中的動(dòng)態(tài)變化，明確其在不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)和不同造血組織（卵黃囊、胎盤、胎肝、骨髓等）的表達(dá)特征；研制內(nèi)皮特異性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠；完善小鼠胚胎發(fā)育中期生血內(nèi)皮數(shù)量功能檢測的技術(shù)手段；對(duì)上述條件基因剔除小鼠的生血內(nèi)皮和定向造血體外發(fā)育潛能進(jìn)行檢測；利用小鼠基因組DNA為模板，通過PCR擴(kuò)增獲得Endomucin、EphB4等系列特異性分子標(biāo)記物的啟動(dòng)子；研制相關(guān)啟動(dòng)子控制的Cre轉(zhuǎn)基因載體；（5）分選獲得不同年齡段人HSC，并利用SCF等細(xì)胞因子進(jìn)行培養(yǎng)、擴(kuò)增，結(jié)合前幾個(gè)部分的研究內(nèi)容，分析不同來源的HSC中p53,p16通路中關(guān)鍵因子表達(dá)以及DNA甲基化等表達(dá)遺傳學(xué)特征。與此同時(shí)，建立HSC重編程為iPS細(xì)胞的技術(shù)平臺(tái)。2、預(yù)期目標(biāo)(1)明確Puma、iASPP基因缺失后，HSC的免疫表型及數(shù)目、HSC的細(xì)胞周期及CKI蛋白的表達(dá)情況的變化。明確不同年齡小鼠的pl8/p21的比例及p16p19的表達(dá)水平。(2)獲得足夠數(shù)量的用于衰老研究的實(shí)驗(yàn)小鼠隊(duì)列，包括Terc+/+GADD45a+/+，G3Terc-/-GADD45a+/+,Terc+/+GADD45a-/-,G3Terc-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠，以及ATM+/+GADD45a+/+,ATM-/-GADD45a+/+，ATM+/+GADD45a-/-，ATM-/-GADD45a-/-四種基因型的小鼠的研究隊(duì)列。獲得至少三種類型的HSC突變株：HSC增多、減少、遷移和分布異常；初步發(fā)現(xiàn)1-2個(gè)造血發(fā)育的新位點(diǎn)；明確1-2個(gè)HSC發(fā)育的特征性新標(biāo)志；明確內(nèi)皮特異性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠生血內(nèi)皮數(shù)量和內(nèi)皮生血體外功能是否異常；研制獲得2-3種特定內(nèi)皮細(xì)胞分子標(biāo)志的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的Cre轉(zhuǎn)基因載體；(4)分離不同年齡階段的HSC，分析其表觀遺傳學(xué)特征年度1、研究內(nèi)容(1)利用Puma基因敲除的小鼠模型，通過競爭性骨髓移植實(shí)驗(yàn)方法分析Puma缺失對(duì)不同年齡階段的小鼠HSC的功能，特別是自我更新的能力的影響。分離ATF-4-/-小鼠的HSC后，研究HSC/HPC細(xì)胞周期的特點(diǎn)，并從細(xì)胞周期調(diào)控蛋白的水平、功能等方面研究該模型HSC細(xì)胞周期調(diào)控的機(jī)制與特點(diǎn)。建立骨髓MSC數(shù)量減少或功能缺失的動(dòng)物模型。繼續(xù)建立并維持用于衰老研究的實(shí)驗(yàn)小鼠隊(duì)列。記錄各種基因型小鼠的體重、活動(dòng)能力、外周血計(jì)數(shù)和生存時(shí)間，分析各種基因型小鼠的生存曲線。通過流式細(xì)胞術(shù)分析各種基因型小鼠造血系統(tǒng)的衰老表現(xiàn)以及造血干細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)維持。利用端粒酶、ATM缺失小鼠，觀察老年小鼠HSC中ROS升高是否伴隨有N0X4的高表達(dá)。對(duì)所獲得的斑馬魚HSC突變株進(jìn)行證實(shí)，并進(jìn)行全基因組掃描和步移、定位克隆突變基因，使用Morpholinoknock-down技術(shù)和Rescue技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)該突變基因?yàn)楹蜻x基因；基于上述發(fā)現(xiàn)的新的造血位點(diǎn)，通過體外器官培養(yǎng)、誘導(dǎo)后移植、Ncx-1基因敲除小鼠等進(jìn)一步明確其造血潛能是否原位發(fā)生；分析Rictor/mTOR、p53通路相關(guān)分子、不同CKI等基因敲除小鼠的胚胎中定向造血發(fā)育的表型；深入內(nèi)皮特異性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠內(nèi)皮生血功能的研究，尤其是通過移植重建實(shí)驗(yàn)考察其造血干細(xì)胞前體的數(shù)量和功能；通過顯微注射構(gòu)建Cre轉(zhuǎn)基因小鼠；利用PCR和Southern雜交篩選攜帶外源基因的轉(zhuǎn)基因首建者小鼠。傳代保種獲得更多數(shù)量的轉(zhuǎn)基因小鼠；誘導(dǎo)HSC形成iPS細(xì)胞。觀察不同來源細(xì)胞所形成iPS細(xì)胞的能力是否有差異。研究不同年齡階段的端粒酶敲除小鼠或者ATM基因敲除小鼠的鼠尾成纖維細(xì)胞(TTFs)或者HSC在體外誘導(dǎo)生成iPS細(xì)胞的效率。2、預(yù)期目標(biāo)(1)明確Puma基因缺失后不同年齡階段的小鼠HSC的功能，特別是自我更新的能力的變化。明確ATF-4基因缺失后，小鼠的HSC/HPC細(xì)胞周期的特點(diǎn)與調(diào)控機(jī)制。建立骨髓MSC數(shù)量減少或功能缺失的動(dòng)物模型。在建立并維持用于衰老研究的實(shí)驗(yàn)小鼠隊(duì)列的基礎(chǔ)上，對(duì)各種基因型小鼠在衰老過程中的各種表型進(jìn)行初步分析，獲得各個(gè)組織器官衰老的基本數(shù)據(jù)，尤其是造血系統(tǒng)衰老的各種具備數(shù)據(jù)，為進(jìn)一步研究HSC的功能奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。初步獲得4-6個(gè)與斑馬魚HSC的發(fā)育過程相關(guān)的基因；完整、深入認(rèn)識(shí)新的HSC發(fā)育位點(diǎn)的特征；闡明1-2個(gè)基因?qū)π∈驛GM區(qū)HSC發(fā)育的調(diào)控作用；明確內(nèi)皮特異性Tbr2和Smad4基因剔除小鼠生血內(nèi)皮體內(nèi)的造血重建潛能；構(gòu)建1-2種特定內(nèi)皮細(xì)胞群體表達(dá)的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠；分析不同年齡段HSC重編程為iPS細(xì)胞效率年度1、研究內(nèi)容分離Puma基因敲除小鼠的HSC，在體外利用單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)對(duì)HSC的增值動(dòng)力學(xué)及分化潛能進(jìn)行分析。iASPP在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用。利用體外HSC的長周期培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、骨髓競爭移植實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)ATF-4-/-小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢的功能。利用體外HSC的長周期培養(yǎng)、單細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)重建造血實(shí)驗(yàn)、骨髓競爭移植實(shí)驗(yàn)等評(píng)價(jià)p18-/-或p21-/-的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢的功能。通過競爭性HSC移植實(shí)驗(yàn)，分析各種基因型小鼠HSC自我更新能力和分化潛能的改變。將野生型小鼠HSC移植入各種基因型小鼠體內(nèi)，研究干細(xì)胞環(huán)境的改變對(duì)正常HSC自我更新能力和分化潛能的影響。利用NOX4抑制劑或RNA干擾技術(shù)抑制NOX4表達(dá)對(duì)老年小鼠HSC的自我更新能力及ROS升高是否具有改善作用。分析測定老年小鼠及氧應(yīng)激暴露小鼠（照射或DNA損傷藥物）HSC中DNA雙鏈斷裂損傷及由ROS誘導(dǎo)的DNA損傷產(chǎn)物羥基-2'脫氧鳥嘌吟核苷（8-OH-dG）含量與HSC功能損傷的關(guān)系。（3）斑馬魚HSC突變基因和所累積信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑的功能研究；明確AGM區(qū)血液血管干細(xì)胞（BL-CFC）的表面分子特征；結(jié)合上述結(jié)果，流式多參數(shù)分選小鼠E10.5胚胎AGM區(qū)單細(xì)胞（如：Flk-l+CD34+c-Kit+）單孔接種后分析血管和HSC功能；構(gòu)建Flk-1p/eGFP報(bào)告載體，制備穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Flk-1p/eGFP的內(nèi)皮細(xì)胞系（無生血功能），通過cDNA表達(dá)文庫和RNAi文庫轉(zhuǎn)染獲得GFP-細(xì)胞克隆（候選的生血內(nèi)皮細(xì)胞）；或者制備轉(zhuǎn)基因小鼠，分選AGM區(qū)PECAM-1+GFP-（生血內(nèi)皮）和PECAM-1+GFP+（非生血內(nèi)皮）細(xì)胞，進(jìn)行功能基因組生物芯片比較分析；對(duì)上述生血內(nèi)皮數(shù)量功能缺陷的Smads信號(hào)通路分子缺失的小鼠，進(jìn)行生血內(nèi)皮調(diào)控的分子機(jī)制研究；對(duì)前期研制的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠與報(bào)告基因小鼠ROSA26交配，利用LacZ染色、流式細(xì)胞FDG分選等方式對(duì)Cre轉(zhuǎn)基因在胚胎不同發(fā)育時(shí)間的表達(dá)、胚胎和成體各造血位點(diǎn)表達(dá)的組織特異性以及貢獻(xiàn)進(jìn)行鑒定分析。（4）建立誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向HSC/HPC分化的體系，然后對(duì)誘導(dǎo)獲得的造血干/祖細(xì)胞進(jìn)行分選富集與鑒定。并在此基礎(chǔ)上特異性誘導(dǎo)造血干/祖細(xì)胞定向分化為紅系細(xì)胞，對(duì)誘導(dǎo)分化的紅系細(xì)胞的表型和功能進(jìn)行檢測。2、預(yù)期目標(biāo)（1）明確Puma基因缺失后，小鼠的HSC的增值動(dòng)力學(xué)及分化潛能變化特點(diǎn)。明確iASPP基因在HSC自我更新、多向分化和增殖中的作用。明確ATF-4基因?qū)π∈蟮腍SC及其干細(xì)胞巢功能的影響。明確p18及p21對(duì)不同年齡小鼠的HSC及其干細(xì)胞巢功能的影響。（2）在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，主要分析和研究HSC的自我更新能力和分化潛能在自然衰老和應(yīng)激損傷過程中的變化。通過骨髓移植實(shí)驗(yàn)，明確造血干細(xì)胞環(huán)境的改變對(duì)正常HSC的自我更新能力和分化潛能的影響。（3）識(shí)別2-4個(gè)對(duì)斑馬魚HSC的發(fā)育、遷移和自我更新有重要調(diào)控作用的基因；闡明血液血管干細(xì)胞產(chǎn)生HSC的潛能；篩選獲得候選的HSC發(fā)育的調(diào)節(jié)基因；初步闡明Smads信號(hào)通路調(diào)節(jié)生血內(nèi)皮特化的分子機(jī)制；利用構(gòu)建的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠的造血譜系示蹤揭示生血內(nèi)皮新的分子特征；iPS細(xì)胞向HSC定向誘導(dǎo)分化年度1、研究內(nèi)容(1)構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，采取干擾的方法降低正常干細(xì)胞Puma基因的表達(dá)水平，再進(jìn)行HSC連續(xù)移植實(shí)驗(yàn)，觀察對(duì)HSC移植率的影響。采取競爭移植方法觀察降低Puma基因表達(dá)對(duì)重建造血的影響。用基因芯片比較ATF-4-/-小鼠和正常小鼠HSC基因表達(dá)的差異，并用實(shí)時(shí)定量PCR加以驗(yàn)證。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選擇1-2個(gè)目的基因進(jìn)行干預(yù)，觀察對(duì)HSC數(shù)目及功能的影響。用基因芯片技術(shù)對(duì)不同CKI單基因及雙基因敲除模型的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的基因表達(dá)水平進(jìn)行分析。研究MSC數(shù)量減少或功能缺失導(dǎo)致的HSC以及成熟血細(xì)胞的變化。(2)利用單個(gè)HSC體外克隆實(shí)驗(yàn)，分析各種基因型小鼠HSC增殖動(dòng)力學(xué)、自我更新能力維持和分化潛能的改變。利用不同模式動(dòng)物的模型以及通路蛋白抑制劑闡明端粒缺陷及NOX來源的ROS對(duì)HSC細(xì)胞周期調(diào)控的影響包括與p53/p21、p38/p16信號(hào)通路蛋白調(diào)節(jié)的相關(guān)關(guān)。利用端粒酶、ATM缺失小鼠在DNA損傷應(yīng)激刺激時(shí)(不同劑量全身照射及DNA損傷誘導(dǎo)劑)，HSC中NOX4表達(dá)及與HSC功能改變的關(guān)系。利用N0X4缺陷小鼠與端粒酶缺陷小鼠或ATM缺陷小鼠雙敲除,進(jìn)一步探討NOX4產(chǎn)生的ROS在HSC衰老中的意義。(3)評(píng)估該突變基因和所累積的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑在人類HSC發(fā)育和白血病腫瘤干細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的地位和作用；利用基因剔除小鼠在血液血管干細(xì)胞水平研究Smads信號(hào)分子(Smad2,Smad3,Smad4,Smad5等)的造血是否異常；利用我們新研制的Cre轉(zhuǎn)基因小鼠驗(yàn)證之前利用Tie2-Cre轉(zhuǎn)基因小鼠獲得的Smads信號(hào)條件剔除小鼠生血內(nèi)皮缺陷的功能結(jié)果；選取前述斑馬魚和小鼠模型篩選的5-8個(gè)候選基因，制備基因過表達(dá)和敲減載體，分別感染小鼠胚胎干細(xì)胞和胚胎AGM區(qū)細(xì)胞，以評(píng)價(jià)該基因在小鼠胚胎造血發(fā)育中的意義；若需要，可制備基因敲除小鼠作更詳細(xì)分析。(4)探討p53、p16等遺傳學(xué)因素和DNA甲基化等表觀遺傳學(xué)因素在iPS細(xì)胞生成和分化中的作用和調(diào)控機(jī)制，并篩選鑒定不同衰老程度的HSC中可能影響iPS細(xì)胞生成和分化的因素并明確其作用。2、預(yù)期目標(biāo)(1)明確Puma基因?qū)π∈笾亟ㄔ煅挠绊?。比較ATF-4-/-小鼠和正常小鼠HSC基因表達(dá)的差異。根據(jù)實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)果，選擇1－2個(gè)目的基因進(jìn)行干預(yù)，明確其對(duì)HSC數(shù)目及功能的影響。明確不同CKI單基因及雙基因敲除模型的幼鼠、成年鼠及衰老小鼠的基因表達(dá)水平。明確MSC數(shù)量減少或功能缺失對(duì)HSC以及成熟血細(xì)胞的影響。進(jìn)一步研究HSC衰老的分子機(jī)制。通過對(duì)HSC增殖動(dòng)力學(xué)的研究，明確細(xì)胞周期調(diào)控蛋白和p53/p21、p38/pl6信號(hào)通路在HSC衰老中的作用。明確N0X4在ROS引起的HSC衰老中的作用。