銅綠假單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

銅綠假單胞菌的分離鑒定及耐藥性分析

銅綠假單胞菌（pseudykorriza）是一種非發(fā)酵糖皮質(zhì)激素的陰性菌。這是醫(yī)院感染的主要病原體之一。碳青霉烯類抗生素通常用作多藥耐藥銅綠假單胞菌感染治療的最后手段。然而,醫(yī)院內(nèi)銅綠假單胞菌感染治療廣泛應(yīng)用碳青霉烯類抗生素導(dǎo)致該菌對多種碳青霉烯類抗生素耐藥的出現(xiàn)。近年耐碳青霉烯類抗生素的銅綠假單胞菌分離株日益增多,并且出現(xiàn)了產(chǎn)金屬β內(nèi)酰胺酶(metallo-betalactamases,MBL)的銅綠假單胞菌。到目前為止,國內(nèi)外均在銅綠假單胞菌中檢測到了MBL,但湖南地區(qū)尚未見對銅綠假單胞菌攜帶金屬酶基因的研究報道。本院革蘭陰性菌中銅綠假單胞菌所占比率一直處于首位材料和方法一、金屬酶表型初篩試驗200株銅綠假單胞菌分離自我院2010年11月—2011年4月臨床各科室送檢標(biāo)本,分別分離自:痰液及支氣管分泌物142株,膿液、分泌液、引流液或穿刺液34株,尿液8株,血液6株,糞便5株,膽汁3株,導(dǎo)管尖端2株,同一患者同一部位分離相同菌株不重復(fù)計入。銅綠假單胞菌ATCC27853作為金屬酶表型初篩試驗質(zhì)控菌株;產(chǎn)IMP-1的銅綠假單胞菌為陽性對照,由上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院惠贈。二、儀器、試劑和儀器VITEK-2全自動微生物鑒定與藥敏試驗分析儀(法國生物梅里埃公司),ABI2720基因擴增儀(美國ABI公司),3730XL測序儀(美國ABI公司),亞胺培南(10μg/片,英國OXOID公司);EDTA(0.5mol/L,pH8.0,4μL/片,自制);2×TaqPCRMasterMix體系(美國Omega公司);D2000(北京天根生化科技公司);IMP,VIM,NDM,SPM及IntI1上下游引物(上海生工生物工程公司)。三、確定細(xì)菌和藥物過敏試驗所有菌株均經(jīng)VITEK-2全自動微生物鑒定與藥敏試驗分析系統(tǒng)(法國生物梅里埃公司)進行鑒定及藥敏試驗。四、生物藥敏試驗?zāi)z片與空白紙片的比例按標(biāo)準(zhǔn)紙片擴散法藥敏試驗操作規(guī)程,用0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z菌涂布MH平皿,然后分別貼IPM藥敏試驗紙片和一空白紙片,兩者相距10mm(邊緣距邊緣),在空白紙片上滴加0.5mol/LEDTA4μL。35℃孵育18~24h,若IPM紙片靠近EDTA紙片一側(cè)出現(xiàn)抑菌效果增強或出現(xiàn)“匙孔”現(xiàn)象,判定受試菌產(chǎn)金屬酶五、綜合子基因檢測：ml基因(一)總dna和優(yōu)質(zhì)粒dna的提取細(xì)菌總DNA采用煮沸法提取,質(zhì)粒DNA采用PlasmidMiniKit(Omega,USA)提取,-20℃保存?zhèn)溆谩?二)pcr檢測machi基因和i類融合子基因以總DNA和質(zhì)粒DNA為模板分別進行IMP、VIM、SPM、NDM型MBLs基因及Ⅰ類整合子基因的PCR擴增,各引物序列根據(jù)文獻(三)基因混合試驗以質(zhì)粒DNA為模板,MBL基因PCR擴增陽性的產(chǎn)物送武漢華大基因有限公司測序,測序結(jié)果在GenBank網(wǎng)上進行Blast比對。一、西醫(yī)融合科5.5%,19.20,常見并發(fā)癥,6.200株菌株主要分離自ICU27.5%(55/200),神經(jīng)外科11.5%(23/200),中西醫(yī)結(jié)合科9.5%(19/200),骨科7.0%(14/200),康復(fù)科5.5%(11/200)和呼吸科5.0%(10/200),其他各科室(如兒科、普外科、感染科、急診綜合病房、腫瘤放療科等)34.0%(68/200)。二、結(jié)果表明，抗癲癇藥物的敏感性試驗200株銅綠假單胞菌中,對美羅培南的耐藥率最低(8.5%),對慶大霉素耐藥率最高(38.5%),見表2。三、試驗結(jié)果為ml表1200株銅綠假單胞菌中有6株為MBL陽性菌株,194株為MBL陰性菌株,其MBL檢出率為3.0%。四、pcr擴增金屬酶及整合酶基因以總DNA及質(zhì)粒DNA為模板分別對6株MBL表型初篩陽性菌株進行金屬酶及整合酶基因擴增,擴增出IMP型陽性2株,未擴增出VIM、SPM和NDM陽性株(圖2);6株MBL表型陽性的銅綠假單胞菌均為Ⅰ類整合子擴增陽性(圖3)。五、imp陽性銅綠假單胞菌感染患者臨床資料的初篩結(jié)果將2株MBL基因測序結(jié)果與GenBank中已知序列比對(http://www.ncbi.nlm.nih.Gov),2株均為IMP-1型。MBL是一類能廣泛水解β內(nèi)酰胺類抗生素的碳青霉烯酶,產(chǎn)該類酶的細(xì)菌對所有β內(nèi)酰胺類抗生素均耐藥,給臨床抗感染治療造成極大困難。本院ICU銅綠假單胞菌的分離率仍居首位,主要分離自下呼吸道標(biāo)本,如痰、支氣管分泌物等,該分布趨勢與李文波等MBL表型初篩試驗顯示,6株銅綠假單胞菌MBL表型初篩陽性,陽性率3.0%(6/200),與2005年本院對銅綠假單胞菌產(chǎn)MBL情況調(diào)查結(jié)果基本一致本研究中IMP陽性銅綠假單胞菌感染的2例患者年齡分別為51歲和78歲,其中1例患者入院前有基礎(chǔ)疾病(該例為高血壓3級),住院時間均在1個月以上,最長者達(dá)103d,且均住在各科室的ICU。2例IMP-1型銅綠假單胞菌感染患者中1例曾有心臟起搏器植入病史,反復(fù)長期使用頭孢孟多、頭孢哌酮-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦、磷霉素和萬古霉素;另1例患者因全身多處擠壓傷、急性腎衰竭和腰椎損傷入院,無基礎(chǔ)疾病,入院后并發(fā)肺部感染,創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)出銅綠假單胞菌,臨床采用頭孢哌酮-他唑巴坦、哌拉西林-他唑巴坦和替考拉寧、去甲萬古霉素交替進行抗感染治療。由此可見,病情較重、有基礎(chǔ)性疾病、住院時間長、長期使用廣譜抗菌藥物是產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌感染的危險因素,監(jiān)測和預(yù)防產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌,尤其是針對危重患者,應(yīng)列為醫(yī)院及相關(guān)實驗室的工作重點。整合子是具有識別并捕獲外源基因并使之轉(zhuǎn)