牛上皮細胞中有效表面標記物的篩選

牛上皮細胞中有效表面標記物的篩選王燕琴;王易之;智宇【摘要】動物上皮細胞容易被多種病毒感染,上皮細胞表面標記物的檢測可以作為表征上皮細胞狀態(tài)的一種手段,但是大多數(shù)上皮細胞表面標記物也會在上皮來源的腫瘤細胞中表達.為了選擇高效、獨特的上皮標記物,采用蛋白質(zhì)印跡法和間接免疫熒光技術，在牛腎上皮細胞(KE)、舌上皮細胞(TE)、甲狀腺上皮細胞(TYE)以及A549細胞和SW480細胞中，檢測了AE3(basiccytokeratin)、AE5(CK3/2p)、CK7、LH1(CK1/10)、EMA(epithelialmembraneantigen)、DesmoplakinI/口(DSPI/口)、E-cadherin和ZO1(zonaoccludens-1)等8種上皮標記物的表達?結(jié)果顯示，與陰性對照相比,AE3、AE5、CK7、EMA及DSPI/H在上皮細胞和上皮細胞來源的A549、SW480腫瘤細胞中表達良好；E-cadherin僅在上皮細胞中表達;LH1(CK1/10)和ZO1在所有被檢測的細胞中都沒有表達?結(jié)果表明,AE3、AE5、CK7、EMA及DSPI/口可以作為有效的上皮細胞及上皮來源的腫瘤細胞標記物,E-cadherin可以作為特異性的上皮細胞標記物.【期刊名稱】《動物醫(yī)學進展》年(卷),期】2019(040)007【總頁數(shù)】6頁(P77-82)【關鍵詞】上皮細胞;腫瘤細胞;表面標記物;間接免疫熒光;細胞角蛋白;細胞緊密連接【作者】王燕琴;王易之;智宇【作者單位】內(nèi)蒙古集寧師范學院,內(nèi)蒙古烏蘭察布012000;西北農(nóng)林科技大學,陜西楊凌712000;西北農(nóng)林科技大學,陜西楊凌712000;內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院,內(nèi)蒙古呼和浩特010051【正文語種】中文【中圖分類】S852.33;S857.4上皮細胞在許多病毒復制過程中可通過模式識別受體感應病毒的病原相關分子模式,從而識別病毒,并啟動抗病毒固有免疫應答。上皮細胞常常被用作模式細胞，而上皮細胞的鑒定通常要到表面標記物。上皮細胞中含有大量亞型的特異性標記物。常用的上皮細胞表面標記物包括細胞角蛋白(cytokeratin,CK)、上皮膜抗原(epithelialmembraneantigen,EMA)、E-cadherin和Desmoplins(DSP)。CK是上皮細胞生長、分化及成熟的特征性標志物，角膜再生醫(yī)學組織工程上皮細胞片利用AE5(cytokeratin3/2p)和ZO1(cytokeratin1/10)抗體作為上皮標記物，涉及到角膜的實驗則大多采用AE5作為標志物。ZO1和E-cadherin也常被用作標記物來檢測上皮細胞是否丟失［1］。DSP是上皮細胞和心肌細胞間質(zhì)斑塊中主要的蛋白質(zhì)。上皮細胞標記物也會在上皮來源的腫瘤細胞中高效表達。比如，EMA是一種廣泛表達于上皮組織的抗原，也是正常腦膜和所有腫瘤的陽性抗原［2］。卵巢周圍原始神經(jīng)外胚層惡性腫瘤檢測時采用AE1和AE3作為表面標記物;脊索瘤細胞表達CK和上皮膜抗原(EMA)；腎外惡性橫紋肌瘤細胞表達EMA,AE3。CK和EMA可以在乳腺癌［3］、血管肉瘤［4］、平滑肌肉瘤［5］、乳頭狀甲狀腺癌［6］等多種腫瘤細胞中表達。CK7和EMA在子宮內(nèi)膜樣腺癌和透明細胞癌中普遍為陽性。本研究比較這8種常用的上皮細胞表面標記物在腎上皮細胞(kidneyepithelialcell，KE)、舌上皮細胞(tongueepithelialcell，TE)、甲狀腺上皮細胞(thyroidepithelialcell,TYE)以及腺癌人類肺泡基底上皮細胞(A549)和人結(jié)腸癌細胞(SW480)中的表達效率，旨在選擇高效、特異性高的上皮細胞表面標記物。材料與方法材料1.1.1細胞和培養(yǎng)基SW480和A549細胞，購自ACCA公司；牛腎臟、舌和甲狀腺組織，采集自西安中樂屠宰場，按照文獻［7］中的方法分離上皮細胞；培養(yǎng)基為DMEM/F12培養(yǎng)基(補充100mL/L的新生牛血清,2mmol/LL-谷氨酰胺,10ng/mL表皮生長因子,100U/mL青霉素,100U/mL鏈霉素)。1.1.2試劑DMEM/F12粉末，SIGMA公司產(chǎn)品；胎牛血清，Hyclone公司產(chǎn)品；表皮生長因子，北京靈寶公司產(chǎn)品；L-谷氨酰胺，西安拉維亞生物科技有限公司產(chǎn)品。1.1.3抗體Anti-Cytokeratin3/2p(AE5:sc-80000)、anti-BasicCytokeratin(AE3:sc-57004)、anti-Cytokeratin1/10(LH1:sc-53251)、anti-E-cadherin(S17:sc-31020)、anti-Cytokeratin7(5F282:sc-70936)，SantaCruz生物公司產(chǎn)品；anti-EMA(2F6:ab156947)、anti-DesmoplakinI+H(ab71690)santi-ZO1(ab59720)抗體，Abcam生物公司產(chǎn)品。方法1.2.1間接免疫熒光試驗大約2x104的細胞滴加于蓋玻片上，置于12孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)培養(yǎng)12h。吸去上清液，在室溫下以40mg/mL多聚甲醛固定細胞10min。PBS洗滌細胞后，以封閉液(50mg/mL牛血清白蛋白，2mL/LtritonX100PBS)封閉/通透30min。加入一抗，孵育2h后以PBS洗滌3次。加入Cy3標記的山羊抗兔IgG,室溫孵育1h;用PBS洗3次，加入Hochest后避光孵育5min~10min;于熒光顯微鏡條件下觀察。1.2.2免疫印跡分析采用全細胞蛋白裂解液進行Westernblot分析。即將6孔培養(yǎng)板內(nèi)的細胞加2.5mg/mL胰酶消化并將細胞收集到1.5mL離心管中，300r/min離心5min。棄上清，加入100pLRIPA細胞裂解液(加入蛋白酶抑制劑混合物)提取。用BCA蛋白定量試劑盒對樣品的總蛋白進行定量，用RIPA調(diào)各樣品濃度至一致。樣品中加入等體積的2xSDS樣品緩沖液,100°C煮10min，置-20C或-70C保存樣品。根據(jù)分子克隆指南中描述的SDS配制方法配制120g/L的分離膠和50g/L濃縮膠并進行電泳。待溴酚藍到達膠的底端附近時停止電泳，取出蛋白膠，進行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜完成后，以TBST洗去轉(zhuǎn)膜液和殘留的凝膠。加入Western封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉2h。取出后，分別加入稀釋的一抗，4C過夜孵育。加入TBST洗膜3次。加入稀釋的二抗，室溫下孵育2h,以TBST洗膜3次。參考說明書，使用化學發(fā)光檢測試劑盒檢測目的蛋白，用X光膠片曝光的方式記錄試驗結(jié)果。結(jié)果經(jīng)過分離，分別得到了牛腎上皮細胞(KE)、舌上皮細胞(TE)和甲狀腺上皮細胞(TYE)(圖1)，并將它們用于后續(xù)的上皮細胞標記物篩選。AE3、AE5、CK7在上皮細胞和上皮來源的腫瘤細胞中表達細胞角蛋白在特定組織中的表達模式可以作為上皮分化的標志。試驗檢測了細胞角蛋白AE3、AE5、CK7以及LH1在3種上皮細胞(KE、TE和TYE)和2種腫瘤細胞(A549、SW480)中的表達。AE3、AE5和CK7在上皮細胞和腫瘤細胞中高效表達間接免疫熒光結(jié)果(圖2)顯示：在被檢的3種上皮細胞中，AE3、AE5和CK7腎上皮細胞中的熒光強度顯著低于它們在牛舌上皮細胞和牛甲狀腺上皮細胞中的強度。在KE中，CK7的強度高于AE3和AE5;在TE中，AE3、AE5和CK7的熒光強度都很高，且強度基本一致；在TYE中，AE3和CK7的熒光強度高于AE5。相對于上皮細胞來說，腫瘤細胞中檢測到的熒光強度比較低。在A549和SW480細胞中，AE3、AE5和CK7均檢測到熒光信號，且信號強度比較一致。在3種CK中，AE3和CK7的熒光強度大于AE5，這一點與上皮細胞中的結(jié)果一致。Westernblot結(jié)果顯示,AE3和CK7在KE、TE、TYE、A549及SW480細胞中表達量高于AE5；CK7在SW480細胞中的表達量低于其他被檢細胞（圖3）。LH1在上皮細胞和腫瘤細胞中表達量低與其他3種CK不同，在正常上皮細胞（KE、TE、TYE）和腫瘤細胞（A549及SW480）中均未檢測到LH1的熒光表達。Westernblot在KE、TE、TYE中僅有微量的LH1蛋白表達被檢測到。KE.腎上皮細胞；TE.舌上皮細胞；TYE?甲狀腺上皮細胞KE.Kidneyepithelialcell；TE.Tongueepithelialcell；TYE.Thyroidepithelialcell圖13種牛上皮細胞Fig.1Threekindsofbovineepithelialcells圖2上皮細胞及腫瘤細胞的間接免疫熒光染色結(jié)果Fig.2IndirectimmunofluorescencestainingresultsofepithelialcellsandtumorcellsDSPI/H在上皮細胞和腫瘤細胞中高效表達DSPI和DSP口是定位于橋粒斑塊最內(nèi)側(cè)的高度相關蛋白，是連接中間絲和橋粒復合體的候選蛋白°DSPI存在于所有上皮細胞中,DSP口表達于牛、豬、猴和人除甲狀腺濾泡上皮外的所有被檢上皮細胞中。間接免疫熒光結(jié)果（圖2）顯示，DSPI/n在上皮細胞中的熒光強度高于腫瘤細胞。其中，TE、TYE的熒光強度高于KE,SW480中的熒光強度高于A549。Westernblot檢測（圖3）顯示，KE、TE、TYE、A549中均檢測到DSPI/H的表達，SW480中僅有DSPI的表達。EMA在上皮細胞和腫瘤細胞中高效表達上皮細胞膜抗原（EMA）或MUC1屬于一組高度糖基化的異質(zhì)性蛋白，在大多數(shù)正常和上皮腫瘤細胞中表達。EMA也表達于漿細胞、腫瘤大細胞淋巴瘤（Ki-1抗原）、惡性組織細胞病和紅血球白血病中。因此EMA既可以作為上皮細胞標志物，又可以用于腫瘤的組織學預后標準。檢測了EMA的表達，結(jié)果如圖2和圖3。在KETE、TYE、A549和SW480均檢測到了EMA的熒光表達。與CK和DSP不同，EMA在上皮細胞和腫瘤細胞中的熒光強度區(qū)別不明顯，在TYE和SW480中的熒光強度高于其他3種細胞。應用Westernblot法，在5種細胞中均檢測到了EMA的表達。E-Cadherin僅在上皮細胞中表達E-cadherin是一種Ca2+依賴性的細胞黏附分子。它對細胞黏附功能的完整至關重要，并在上皮細胞形態(tài)和分化的建立與維持中發(fā)揮作用。如圖2和3所示，試驗僅在上皮細胞中檢測到E-cadherin的表達，TE細胞中E-cadherin的強度高于KE和TYE,A549和SW480細胞中未檢測到E-cadherin的熒光信號。Westernblot檢測結(jié)果顯示，僅上皮細胞KE、TE、TYE中由E-cadherin的表達，KE和TYE的表達量要高于TE。圖3上皮細胞及腫瘤細胞的蛋白印跡結(jié)果Fig.3WesternblotresultsofepithelialcellsandtumorcellsZO1在上皮細胞和上皮來源的腫瘤細胞中均不表達胞質(zhì)緊密黏連蛋白ZO1是骨架蛋白，形成緊密連接膜的分子可以附著在ZO1上角膜再生醫(yī)學組織工程中，常常利用AE5和ZO1抗體作為上皮標記物。在上皮細胞和上皮來源的腫瘤細胞中的免疫熒光和蛋白質(zhì)印跡試驗中，均未檢測到ZO1的表達（圖2和3）。討論角蛋白是一種結(jié)構蛋白，分為硬角蛋白和軟角蛋白；軟角蛋白也被稱為細胞角蛋白（CKs）。CKs主要在上皮細胞中表達，分為I型和口型角蛋白。I型角蛋白，即CKs9-20,呈酸性，分子質(zhì)量為40ku~64ku。口型角蛋白，即CKs1-8，是中性到堿性的，分子量從52ku~68ku不等［8］。細胞角蛋白多肽的模式具有特定組織或細胞類型的特征，或具有上皮組織相關群的特征，使其成為細胞骨架蛋白標志物［9-11］。每一種上皮類型都有明顯的細胞角蛋白多肽結(jié)構，可以用來區(qū)分簡單和復雜的上皮細胞。CK1~3由鱗狀上皮細胞表達，CK5和CK6由間皮細胞特異性表達。非角質(zhì)化的分層上皮如頰黏膜和肺泡黏膜表達CK4和CK13，同時表達CK5和CK14。至U目前為止，研究者們還未發(fā)現(xiàn)具有相同的細胞骨架多肽模式的兩種上皮組織。以前的研究表明角質(zhì)化的分層上皮如舌、腭和皮膚表達CKs1和CKs10,同時表達CKs5和CKs14。本試驗只檢測到了AE3、AE5、CK7在上皮細胞和腫瘤細胞中的表達，未檢測到LH1的表達。Franke等檢測了不同上皮組織之間、不同表皮層之間以及不同培養(yǎng)上皮細胞之間的細胞角蛋白組成的差異。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)被測樣本中的差異不是由于蛋白水解降解造成的，而是合成細胞角蛋白成分的差異。CK3常常被用作角膜上皮細胞分化的標志物，而CK7是已經(jīng)被公認的準確的細胞內(nèi)標記物［12］。與正常的上皮組織相比，在良性和惡性腫瘤中，細胞角蛋白多肽表達的變化也已經(jīng)被觀察到。在癌癥中，角蛋白被廣泛用作診斷性腫瘤標志物，因為上皮惡性腫瘤在很大程度上維持與它們各自的起源細胞相關的特定角蛋白模式，而且在許多情況下，腫瘤和/或外周血中全長或裂口角蛋白表達（或缺乏）對癌癥患者具有預后意義［13］。由于它們的差異依賴性和組織特異性表達，也被用作診斷包括癌癥在內(nèi)的各種上皮疾病的標志物［14］。比如，黑爾膠態(tài)鐵染色是形態(tài)學解釋的有力輔助，但它不是特異性的。當黑爾膠態(tài)鐵染色不確定時，CK7的免疫組織化學染色可用于鑒別診斷腎細胞癌和腎嗜酸細胞瘤［15］。EMA可以在上皮細胞和上皮腫瘤細胞中表達。大多數(shù)上皮腫瘤（包括鱗狀細胞癌、乳腺癌和大細胞肺癌）也可以與EMA抗體反應。因此相比于作為上皮細胞表面標記物，EMA更常被用作腫瘤診斷標志物。比如，聯(lián)合使用胰島素樣生長因子口mRNA結(jié)合蛋白3(IMP3)和EMA比單獨使用IMP3或EMA更有助于區(qū)分惡性間皮瘤和良性間皮瘤［16］。EMA/CK1比值的差異可作為早期乳腺癌患者的診斷指標。CK7和EMA結(jié)合的免疫染色可以鑒別膽管缺失和導管增生［17］。上皮細胞彼此間通過一組復合物連接,包括黏附連接、緊密連接和細胞橋粒［18］。黏附連接由跨膜蛋白E-cadherin和胞漿蛋白catenin介導，定位于鄰近的細胞。本研究表明，E-cadherin在3種正常上皮細胞中均正常存在。E-cadherin最早是在受精卵中就表達，是胚胎第一個形成的上皮細胞-胚泡發(fā)育所必需的。E-cadherin與細胞極化表型的建立和緊密黏附連接的形成有關。除去作為表面標志物被應用，E-cadherin在體內(nèi)的作用也被廣泛研究。比如，它可以作為血小板聚集和血栓穩(wěn)定性的調(diào)節(jié)因子。E-cadherin通過信號傳導和機械機制抑制肉瘤中與錨定無關的生長［19］。Von等在更大范圍的甲狀腺腫瘤中研究了E-cadherin的表達，發(fā)現(xiàn)E-cadherin的表達似乎與甲狀腺癌的去分化進展和擴散有關。緊密連接是細胞間連接的最外層結(jié)構，屬于跨膜蛋白。形成緊密連接膜的分子附著在Z01、Z0-2和ZO-3等骨架蛋白上，通過這些骨架蛋白信號被介導到細胞內(nèi)部。本研究未檢測到ZO1在上皮細胞和腫瘤細胞中的表達，說明ZO1可能并不適合于作為上皮細胞標記物?，F(xiàn)在對ZO1的研究主要是它在生命發(fā)展過程中的作用。血紅素加氧酶通過調(diào)控緊密連接蛋白ZO1,可以提高胎盤滋養(yǎng)細胞的侵襲能力。某些類型的腫瘤表現(xiàn)為ZO1表達下調(diào)，在腫瘤進展中起重要作用。過表達ZO1抑制細胞活力、增殖和遷移，誘導G/G相阻滯［20］。DSP是血小板溶素家族的一種細胞連接蛋白，是細胞間黏附復合物橋粒的重要細胞內(nèi)成分°DSPI和DSP口在溶解度特性、等電點、胰蛋白酶圖譜、氨基酸組成、免疫學標準等方面的相似性決定了它們是密切相關的。研究表明，它們可能來源于—個基因的2個mRNA［21］。VasioukhinV等［22］特異性敲除表皮中的DSP后，發(fā)現(xiàn)表皮完整性需要DSP；機械應力能夠?qū)е聼oDSP皮膚的細胞間分離。本研究結(jié)果表明dspi/h在上皮細胞及上皮細胞性的腫瘤細胞中表達量很高。但研究者很少將DSPI/口用作標記物。現(xiàn)在的研究主要集中于DSP與不同的中間絲類型相互作用，如DSP在斑馬魚早期胚胎發(fā)育中的作用［23］。副腫瘤性天皰瘡自身抗體可以與存在于細胞連接處的蛋白質(zhì)，如DSP及其他蛋白發(fā)生反應。如南美哥倫比亞地區(qū)受地方性葉落天皰瘡新變種影響的患者，其自身抗體與MYZAP、p0071、DSPI/口和ARVCF共定位，可以引起腎臟損害［24］。本研究結(jié)果表明，AE3、AE5、CK7、EMA以及DSP等5種標記物，不但可以在上皮細胞中表達，而且可以在上皮來源的腫瘤細胞中高效表達。相應的，E-cadherin只在上皮細胞中表達，因此可以作為有效的上皮細胞標記物來篩選、標記細胞。參考文獻:【相關文獻】MellasRE,LeighNJ,NelsonJW,etal.ZO-1,Occludin,andE-cadherinexpressionandorganizationinsalivaryglandswithSjogren'ssyndrome[J].ActaHistochemicaEtCytochemicaOffJJpnSociHistochemCytochem,2014,63(1):45-56.SloaneJP,OrmerodMG.Distributionofepithelialmembraneantigeninnormalandneoplastictissuesanditsvalueindiagnostictumorpathology[J].Cancer,1981,47(7):1786-1795.AttallahAM,El-FarM,OmranMM,etal.Circulatinglevelsandclinicalimplicationsofepithelialmembraneantigenandcytokeratin-1inwomenwithbreastcancer:cantheirratioimprovetheresults?[J].TumorBiol,2014,35(11):10737-10745.Al-AbbadiMA,AlmasriNM,Al-QuranS,etal.Cytokeratinandepithelialmembraneantigenexpressioninangiosarcomas:Animmunohistochemicalstudyof33cases[J].ArchPatholLabMed,2007,131(2):288-292.IwataJ,FletcherCDM.Immunohistochemicaldetectionofcytokeratinandepithelialmembraneantigeninleiomyosarcoma:Asystematicstudyof100cases[J].PatholInter,2010,50(1):7-14.TrivinoLopezA,CarlosGonzalezI,YamamotoY,etal.Animmunohistochemicalstudyofepithelialmembraneantigen,cytokeratin,andvimentininpapillarythyroidcarcinoma:Recognitionoflethalandfavorableprognostictypes[J].Cancer(Philadelphia),1993,72(7):2286-2287.RongW,YingHE,LiL,etal.Comparisonoftwomethodsforprimarycultureofepithelialcellsfromhumanbioptictissueofnasopharyngealcarcinoma[J].JSouthMedUniv,2010,30(12):2667-2670.MollR.Cytokeratinsasmarkersofdifferentiation.Expressionprofilesinepitheliaandepithelialtumors[J].VeroffPathol,1993,142:1.FrankeWW,SchillerDL,MollR,etal.Diversityofcytokeratins:Differentiationspecificexpressionofcytokeratinpolypeptidesinepithelialcellsandtissues[J].JMolBiol,1981,153(4):933-959.BarakV,GoikeH,PanaretakisKW,etal.Clinicalutilityofcytokeratinsastumormarkers.[J].ClinBiochem,2004,37(7):529-540.TotT.Cytokeratins20and7asbiomarkers:usefulnessindiscriminatingprimaryfrommetastaticadenocarcinoma[J].EurJCancer,2002,38(6):0-763.SherwoodER,BergLA,MitchellNJ,etal.Differentialcytokeratinexpressioninnormal,hyperplasticandmalignantepithelialcellsfromhumanprostate[J].JUrol,1990,143(1):167-171.KarantzaV.Keratinsinhealthandcancer:morethanmereepithelialcellmarkers[J].Oncogene,2011,30(2):127-138.RaulU,SawantS,DangeP,etal.Implicationsofcytokeratin8/18filamentformationinstratifiedepithelialcells:Inductionoftransformedphenotype[J].InterJCancer,2010,111(5):662-668.LeroyX,MoukassaD,CopinMC,etal.Utilityofcytokeratin7fordistinguishingchromophoberenalcellcarcinomafromrenaloncocytoma[J].EurUrol,2000,37(4):484-487.ChangS,OhMH,JiSY,etal.Practicalutilityofinsulin-likegrowthfactorIImRNA-bindingpr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