交泰丸對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜nf-b表達(dá)的影響

交泰丸對(duì)糖尿病視網(wǎng)膜nf-b表達(dá)的影響

糖尿病性關(guān)節(jié)炎（ri）是糖尿病最常見(jiàn)、最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。這是西方國(guó)家最常見(jiàn)的疾病。據(jù)美國(guó)眼病流行研究小組估計(jì)11.1飼養(yǎng)飼料及管理200只Wistar二級(jí)大鼠,體重165g～195g,雌雄各半,購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所繁育場(chǎng),許可證編號(hào)scxk京2000-0006。喂養(yǎng)飼料購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所營(yíng)養(yǎng)部,許可證編號(hào)scxk京2001-0003。飼養(yǎng)條件:室溫18℃～25℃,空氣流通,相對(duì)濕度55～70%,12h光照維持,晝夜循環(huán)。每日換籠子或加墊料(鋸末)以保持其生活環(huán)境基本干燥。實(shí)驗(yàn)期間各組大鼠自由攝食飲水,不給予胰島素或其他任何降糖藥物。1.2苯磺酸鈣膠囊組交泰丸,實(shí)驗(yàn)劑型為浸膏,由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院廣安門(mén)醫(yī)院藥劑科制作,批號(hào):20040608,規(guī)格:250mL/瓶,含生藥量為1g/mL。陽(yáng)性對(duì)照藥羥苯磺酸鈣膠囊(商品名多貝斯):為毛細(xì)血管循環(huán)改善劑,國(guó)藥準(zhǔn)字H20000713,規(guī)格:0.5g×20粒,單位:盒,生產(chǎn)企業(yè):西安利君制藥股份公司。批號(hào):031229。1.3菌株和儀器STZ,美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京邦定泰克生物技術(shù)有限公司。NF-κB一抗為小鼠單克隆抗體IgG1NF-κBp65(F-6):sc-8008。為美國(guó)SantaCruz公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。胰蛋白酶,1∶250,美國(guó)DAKO公司產(chǎn)品,購(gòu)自北京智旋宏達(dá)科技有限責(zé)任公司。3%胰蛋白酶消化液(臨用時(shí)現(xiàn)配):胰蛋白酶3g+0.01MPBS(pH=7.4)緩沖液100mL。1.4lympusbx-65光學(xué)顯微日本OLYMPUSDP-70數(shù)碼照相裝置(1200萬(wàn)像素)。日本OLYMPUSBX-51光學(xué)顯微鏡。美國(guó)Image-ProPlus5.1圖像分析軟件。穩(wěn)步倍加型血糖儀SureStepTMPlusBIOODGLUCOSEMETER,美國(guó)強(qiáng)生公司LIFESCANINC。1.5造模成功大鼠的分組動(dòng)物適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后,將STZ溶于0.1M、pH=4.6的枸櫞酸、枸櫞酸鈉滅菌緩沖液中,濃度為2%,按51mg/Kg體重立即行左下腹腔注射建立DM動(dòng)物模型,共造模185只。正常對(duì)照組15只僅以等量0.1M、pH=4.6的枸櫞酸、枸櫞酸鈉緩沖液腹腔注射。1周后,所有動(dòng)物禁食8小時(shí)以上,斷尾取血,測(cè)定血糖,將空腹血糖≥16.7mmol/L者151只(♂92♀59)視為DM造模成功大鼠。飼養(yǎng)3月后,將存活的142只DM模型大鼠分層隨機(jī)分組,分為五組:即模型組,羥苯磺酸鈣組,交泰丸高、中、低劑量組。除正常組始終不給藥以外,造模3月后其余各組開(kāi)始給藥:模型組:用與中藥中劑量組等容的蒸餾水灌胃;羥苯磺酸鈣組:用相當(dāng)于臨床用藥量10倍的羥苯磺酸鈣混懸液灌胃;交泰丸高、中、低劑量組分別用相當(dāng)于臨床用藥量20、10、5倍的交泰丸混懸液灌胃。每日給藥1次,每月測(cè)1次體重,以調(diào)整給藥劑量。1.6視網(wǎng)膜免疫組化nf-b的染色給藥3月后隨機(jī)取42只大鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn),20%烏拉坦0.5mL/100g體重腹內(nèi)注射麻醉,放血后立即摘除雙眼眼球,固定于10%福爾馬林溶液內(nèi)48h以上。右眼行視網(wǎng)膜血管消化鋪片,清水沖洗多次并浸泡2h以上,于鋸齒緣后0.5mm處剪開(kāi)眼球壁,去除眼前節(jié)及玻璃體,余下的眼杯盡量以視乳頭為中心,等分成四部分,剝離視網(wǎng)膜,于0.01MPBS溶液中4℃過(guò)夜,于3%胰蛋白酶溶液內(nèi),37℃,孵育2h以消化神經(jīng)成分,停止消化后,取出視網(wǎng)膜置蒸餾水中漂洗與振蕩多次,以使血管外細(xì)胞脫落;反復(fù)吹打,僅留一薄層透明的血管網(wǎng),平鋪于潔凈的涂膠載玻片上,鋪片室溫自然干燥;存放4℃切片盒。免疫組化NF-κB染色。左側(cè)眼球,于鋸齒緣后0.5mm處剪開(kāi)眼球壁,去除眼前節(jié)及玻璃體,余下的眼杯進(jìn)行全層石蠟包埋,制作4μm切片,并行免疫組化NF-κB染色。眼球壁石蠟切片和視網(wǎng)膜血管消化鋪片的免疫組化染色均由OLYMPUSDP-70數(shù)碼照相裝置(1200萬(wàn)像素)聯(lián)合OLYMPUSBX-51光學(xué)顯微鏡系統(tǒng)照相,每張切片或鋪片均選取5張照片以Image-ProPlus5.1軟件進(jìn)行計(jì)算機(jī)圖像分析,計(jì)算染色的平均光密度值,對(duì)NF-κB在視網(wǎng)膜及視網(wǎng)膜血管的表達(dá)進(jìn)行定量分析。眼球壁石蠟切片免疫組化染色步驟:①石蠟切片二甲苯I、II脫蠟各15h,梯度酒精(濃度分別為100%、100%、95%、95%、90%、80%、70%、50%)至水;②自來(lái)水浸洗后抗原修復(fù)(置預(yù)熱3h的檸檬酸鹽緩沖液中,放入微波爐61℃3min);③0.3%H視網(wǎng)膜血管消化鋪片NF-κB免疫組化染色步驟:首先自來(lái)水浸泡視網(wǎng)膜鋪片15min,其余步驟同眼球壁石蠟切片免疫組化染色3～14步。一抗?jié)舛葹?∶50。DAB溶液顯色時(shí)間為10min。1.7選擇反滲透膜的方法,把兩兩比較作為ws-n-k法、s-n-k法、s-n-k法比較使用SPSS14.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行。行單因素方差分析(one-wayanalysisofvariance,One-WayANOVA),兩兩比較采用StudentNewmanKeuls(S-N-K)法,方差不齊性時(shí),兩兩比較采用Games-Howell法。22.1神經(jīng)節(jié)細(xì)胞nf-b的表達(dá)NF-κB在正常組主要表達(dá)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì),表達(dá)較弱。模型組NF-κB被激活,主要表達(dá)于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)核層及外核層的細(xì)胞核。各組大鼠的陰性對(duì)照片未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)發(fā)生。2.2內(nèi)皮細(xì)胞染色正常組和模型組表達(dá)的部位皆為周細(xì)胞而不是內(nèi)皮細(xì)胞(圖7～圖12)。模型組染色深而反應(yīng)強(qiáng),正常組不染色或染色淺,反應(yīng)弱。各組大鼠的陰性對(duì)照片未見(jiàn)陽(yáng)性反應(yīng)發(fā)生。3nf-b二聚體NF-κB是一種以可誘導(dǎo)形式廣泛存在的蛋白質(zhì),在靜息狀態(tài)下,NF-κB的p50/p65亞基與其特異性抑制物IB結(jié)合形成三聚體,覆蓋著p50亞基的核定位序列(nuclearlocalizationsequence,NLS),使NF-κB以非活化的形式滯留在胞漿中。當(dāng)細(xì)胞受到活化刺激,如炎癥、晚期糖化終未產(chǎn)物(advancedglycosylationendproducts,AGEs)、氧化應(yīng)激等,NF-κB二聚體從NF-κB-IB三聚體中釋放出來(lái),暴露了p50亞基的NLS,進(jìn)入活化狀態(tài),移位到細(xì)胞核內(nèi),發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞功能的作用。NF-κB作為一個(gè)具有多向性調(diào)節(jié)作用的核轉(zhuǎn)錄因子,由于對(duì)眾多調(diào)節(jié)血管病變的細(xì)胞因子、黏附分子等均有調(diào)控作用,而被視為DM微血管病變的中心調(diào)節(jié)因子因此N