分子生物學(xué)實驗技術(shù)(核酸的凝膠電泳)課件

第四節(jié)核酸的凝膠電泳NucleicAcidGelElectrophoresis第四節(jié)核酸的凝膠電泳1ContentofTable

前言一、瓊脂糖凝膠電泳二、聚丙烯酰胺凝膠電泳三、脈沖場凝膠電泳ContentofTable前言2前言

核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于分離、鑒定和純化DNA或RNA片段；優(yōu)點：（1）便于分離;（2）便于檢測;（3）便于回收：

前言核酸凝膠電泳是分子克隆核心技術(shù)之一，用于3核酸凝膠電泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團，呈負(fù)離子化狀態(tài)；核酸分子在一定的電場強度的電場中，它們會向正電極方向遷移；2）由于在電泳中往往使用無反應(yīng)活性的穩(wěn)定的支持介質(zhì)，電泳遷移率（或遷移速度）與分子的摩擦系數(shù)成反比。而摩擦系數(shù)是分子大小、介質(zhì)粘度等的函數(shù)；因此，可在同一凝膠中、一定電腸強度下、可在凝膠上分離出不同分子量大小或相同分子量但構(gòu)型有差異的核酸分子。Home核酸凝膠電泳的基本原理1）核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基團4一、瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectrophoresis一、瓊脂糖凝膠電泳

Agarosegelelectro5（一）凝膠的制備及電泳（一）凝膠的制備及電泳6分子生物學(xué)實驗技術(shù)(核酸的凝膠電泳)ppt課件7（二）DNA的遷移速率決定因素（二）DNA的遷移速率決定因素81DNA分子的大小雙鏈DNA分子遷移的速率與其堿基對數(shù)的常用對數(shù)近似成反比；2瓊脂糖濃度濃度越低，相同核酸分子遷移越快；1DNA分子的大小9

3DNA的構(gòu)象

一般同一分子：超螺旋環(huán)狀＞線狀＞切口環(huán)狀。4凝膠和電泳緩沖液中的溴化乙錠

溴化乙錠（EB）插入雙鏈DNA造成其負(fù)電荷減少、剛性和長度增加。3DNA的構(gòu)象105所用的電壓低電壓時DNA片段遷移率與所用的電壓成正比。6瓊脂糖種類常見的有兩種：標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖和低熔點瓊脂糖；5所用的電壓11

不同類型瓊脂糖的性質(zhì)瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/℃標(biāo)準(zhǔn)瓊脂糖35~3890~95不同廠家生產(chǎn)的不同商品其凝結(jié)溫度和熔化溫度有一定差異40~4285~90高強度瓊脂糖34~4385~95修飾的低熔點/凝點瓊脂糖25~3563~653565超低熔點8~1540~45低黏性低熔點瓊脂糖25~307038853075不同類型瓊脂糖的性質(zhì)瓊脂糖類型凝結(jié)溫度/℃熔化溫度/12不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)(kb)高強度(kb)低熔點(kb)低黏度低溶點(kb)0.31~500.50.7~250.80.5~150.8~100.8~101.00.25~120.4~80.4~81.20.15~60.3~70.3~71.50.08~40.2~40.2~42.00.1~30.1~33.00.05~10.5~14.00.1~0.56.00.01~0.1不同類型瓊脂糖分離DNA片段的范圍濃度（%）標(biāo)準(zhǔn)高強度137電泳緩沖液常用的有TAE、TPE及TBE7電泳緩沖液14TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖液。三者相比：1）TAE的緩沖容量最低，如長時間電泳會被消耗，此時凝膠的陽極一側(cè)將發(fā)生酸性化；2）TBE和TPE比TAE花費稍貴，但有高得多的緩沖容量；3）雙鏈線狀DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中遷移快10%；4）對于高分子質(zhì)量的DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，對于低分子質(zhì)量的DNA，TAE要差些。超螺旋DNA在TAE中的電泳分辨率要好于TBE。TAE、TPE及TBE電泳緩沖液比較都是常用電泳緩沖15（二）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待電泳的樣品相混合的一種緩沖液。載樣緩沖液有三個作用：1）增加樣品密度保證DNA沉入加樣孔內(nèi)；2）使樣品帶有顏色便于簡化上樣過程；3）其中的染料在電場中以可以預(yù)測的泳動速率向陽極遷移。（二）凝膠載樣緩沖液載樣緩沖液：臨上樣到凝膠加樣孔之前與待166×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF40%(m/V)蔗糖水溶液II0.25%溴酚藍(lán)室溫0.25%二甲苯氰FF15%Ficoll(Type400)水溶液III0.25%溴酚藍(lán)4℃0.25%二甲苯氰FF30%甘油水溶液IV0.25%溴酚藍(lán)4℃40%(m/V)蔗糖水溶液6×凝膠載樣緩沖液類型6×緩沖液貯存溫度I0.25%溴酚藍(lán)17（三）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測通過染色,紫外燈下檢測。主要有溴化乙錠（ethidiumbromide,EB）染色法和SYBRGold染色法。（三）瓊脂糖凝膠中DNA的檢測通過染色,紫外燈下檢測181凝膠的EB染色1凝膠的EB染色19分子生物學(xué)實驗技術(shù)(核酸的凝膠電泳)ppt課件20分子生物學(xué)實驗技術(shù)(核酸的凝膠電泳)ppt課件21使用EB染色注意事項（1）EB被認(rèn)為是一種強致癌物質(zhì)（2）EB可用來檢測單鏈或雙鏈核酸使用EB染色注意事項（1）EB被認(rèn)為是一種強致癌物質(zhì)22

（3）EB使用時的配制、貯存及使用EB常用水配制成10mg/ml的貯存液，于室溫保存在棕色瓶或用鋁箔包裹的瓶中，使用終濃度為0.5μg/ml。（3）EB使用時的配制、貯存及使用23（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳，電泳結(jié)束后再用EB染色。（4）當(dāng)要知道DNA片段準(zhǔn)確大小時，凝膠應(yīng)在無EB情況下電泳242凝膠SYBRGold的染色SYBRGold是一種新型極敏感染料的商品名稱。其與DNA結(jié)合的親和力高，并且結(jié)合后，能夠極大增強熒光信號。2凝膠SYBRGold的染色SYBRGold是一25（四）凝膠中DNA的成像可以用透射或入射紫外光對EB染色的凝膠成像，圖像可以直接輸出到計算機觀察。（四）凝膠中DNA的成像可以用透射或入射紫外光對EB染色26（五）凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收：存在的主要問題：1不能有效的回收大片段DNA2不能有效回收少量DNAHome（五）凝膠中DNA的回收現(xiàn)一般采用試劑盒回收：Home27二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidegelelectrophoresis

PAGE二、聚丙烯酰胺凝膠電泳

polyacrylamidege28分子生物學(xué)實驗技術(shù)(核酸的凝膠電泳)ppt課件29在TEMED(四甲基乙二胺)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生的自由基的存在下，丙烯酰胺單體的乙烯基聚合形成聚丙烯酰胺的線狀長鏈。在雙功能交聯(lián)劑如N，N`-亞甲雙丙烯酰胺的參與下的共聚合反應(yīng)中，聚丙烯胺的交聯(lián)形成三維帶狀網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。網(wǎng)格孔徑的平均直徑?jīng)Q定于丙烯酰胺和雙功能交聯(lián)劑的濃度。（一）聚丙烯酰胺凝膠的本質(zhì)在TEMED(四甲基乙二胺)催化過硫酸銨還原產(chǎn)生30CH2=CH-C(O)-NH2

(丙烯酰胺）

CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2

（N，N`-亞甲雙丙烯酰胺）CH2=CH-C(O)-NH231（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳種類1變性聚丙烯酰胺凝膠

用于單鏈DNA片段的分離或純化。

變性的DNA在這些凝膠中的遷移率幾乎與其堿基組成及序列完全無關(guān)。用途：放射性DNA探針的分離、DNA測序反應(yīng)等。（二）聚丙烯酰胺凝膠電泳種類1變性聚丙烯酰胺凝膠32

2非變性聚丙烯酰胺凝膠

用于雙鏈DNA片段的分離和純化。注：遷移率受其堿基組成和序列的影響。用途：制備高純度的DNA片段。2非變性聚丙烯酰胺凝膠33（三）DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）有效分離范圍（bp）二甲苯氰FF溴酚藍(lán)3.51000~20004601005.080~500260658.060~4001604512.040~200702015.025~150601520.06~1004512注:N,N`-亞甲雙丙烯酰胺的濃度為丙烯酰胺的1/30;Home（三）DNA在聚丙烯胺凝膠中的有效分離范圍丙烯酰胺濃度（%）34三、脈沖場凝膠電泳

pulsed-fieldgelelectrophoresis

PFGE三、脈沖場凝膠電泳

pulsed-fieldgelel35為何選PFGE？

超過一定大小的線狀雙鏈DNA分子在瓊脂糖凝膠中以相同速率遷移。大于該極限長度（40kb）后DNA的遷移速率幾乎與分子大小無關(guān)，而主要決定于電場強度。但PEGE解決了這一問題。

為何選PFGE？36（一）PFGE工作的基本原理

這種電泳是在兩個不同方向的電場周期性交替進行的。DNA分子在交替變換方向的電場中作出反應(yīng)所需的時間取決于它的大小。該法可分離長至5Mb的DNA分子。嚴(yán)格說來，應(yīng)叫交替電場凝膠電泳。（一）PFGE工作的基本原理37B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖B+A-+A-B脈沖電場電泳示意圖38（二）PEGE類型垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(verticalpulsedfield)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)(fieldinversion)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)(rotatinggel)箝位勻強電場系統(tǒng)(contour-clampedhomogeneouselectricfield)（二）PEGE類型垂直脈沖場電泳系統(tǒng)(verticalpu39A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋轉(zhuǎn)膠系統(tǒng)A-+AB-+BA-+AB-+B-+A-+AB-+B垂直交變電場系統(tǒng)場翻轉(zhuǎn)系統(tǒng)箝位勻強電場系統(tǒng)旋40（三）影響分辨率的因素1脈沖時間（0.1s-1000s)：增加脈沖時間分離較大分子，減少脈沖時間分離較小分子。2電壓：若固定脈沖時間，增