布病檢測方法及質(zhì)量控制課件

布病檢測方法及質(zhì)量控制布病檢測方法及質(zhì)量控制1一、布病診斷布病的診斷過程可分為初步診斷和實驗室診斷。初步診斷實驗室診斷流行病學(xué)調(diào)查臨床診斷病理診斷病原學(xué)血清學(xué)一、布病診斷布病的診斷過程可分為初步診斷和實驗室診斷。流行病2（一）初步診斷

1流行病學(xué)調(diào)查

（1）疫區(qū)內(nèi)動物基本情況，免疫情況，免疫監(jiān)測情況等。（2）本次疫病的流行情況，包括最初發(fā)病時間，地點，疫情，是否在短時間內(nèi)出現(xiàn)許多明顯的流產(chǎn)癥狀。本地區(qū)過去曾否出現(xiàn)過布病，附近地區(qū)近期是否有布病發(fā)生，是否有其它地方引進動物或有其它地方人員來參觀。

（3）本地相關(guān)動物管理制度，牲畜流動，檢疫屠宰情況，氣候、地理、交通情況等。（一）初步診斷1流行病學(xué)調(diào)查3

2臨床診斷（1）最初階段的臨床癥狀不明顯。（2）隨著病程的發(fā)展，布病會引起母畜流產(chǎn)、死胎、不孕和子宮內(nèi)膜炎等。（3）雄性動物出現(xiàn)附睪炎和睪丸炎。2臨床診斷4

3病理學(xué)診斷

（1）胎衣呈黃色膠東樣浸潤，有些部位覆有纖維蛋白絮片，有出血點。（2）胎兒胃中有淡黃色或白色黏液絮狀物，腸胃和膀胱的漿膜下可見有點狀或線狀出血。（3）皮下呈出血性漿液性浸潤。（4）淋巴，脾臟和肝臟有不同程度腫脹。（5）期待呈漿液性浸潤，肥厚。可能有肺炎病灶。3病理學(xué)診斷5（二）實驗室診斷

實驗診斷主要是運用實驗技術(shù)和方法，通過感官、試劑反應(yīng)、儀器分析和動物實驗等手段進行的診斷。布病的實驗室診斷包括病原學(xué)，血清學(xué)診斷。（二）實驗室診斷實驗診斷主要是運用實驗技術(shù)和方法，通過感6

1病原學(xué)診斷屬種型布魯氏菌與否？牛、羊、豬種布魯氏菌？變型1,2,3……（1）病原分離鑒定

將病料中（組織或奶樣）的病原進行分離培養(yǎng)，并對其屬、種、型進行分析。從而判定該疑似病原是否屬于布魯氏菌屬，屬于布魯氏菌屬的那個種（流產(chǎn)，豬，羊等），屬于該種布魯氏菌的哪個變型。1病原學(xué)診斷屬種型布魯氏菌與否？牛、羊7布病檢測方法及質(zhì)量控制ppt課件8優(yōu)點：

診斷結(jié)果明確，是布病診斷的“金標準”。

能對流行菌株進行分型，流行病學(xué)價值高。缺點：

費時檢測需要花費近一周的時間，不適用于大規(guī)模的檢測。

費錢需要高級別的生物安全實驗室及生物安全管理體系，適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，這些都需要花費大量的財力。不敏感，不易采樣。優(yōu)點：9（2）PCR

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，PCR等技術(shù)得到廣泛應(yīng)用。我們實驗室使用的主要是多重PCR技術(shù)，來對布魯氏菌的種型進行分析。其擴增的目的條帶是細菌基因組中廣泛分布的基因片段。通過電泳條帶比較分析，揭示基因組間的差異。該方法特異性強，靈敏度高，簡單快捷。（2）PCR10引物如下:引物如下:11反應(yīng)條件如下：

95℃7min預(yù)變性；然后進行25個循環(huán)的擴增（95℃35s，64℃45s，72℃3min），最后72℃延伸10min，4℃保存。反應(yīng)條件如下：12結(jié)果判定：電泳同時出現(xiàn)152bp、794bp和1682bp3條條帶，為牛種布魯氏菌；電泳同時出現(xiàn)152bp、794bp、1071bp和1682bp4條條帶，為羊種布魯氏菌；電泳同時出現(xiàn)152bp、794bp和1071bp3條條帶，為綿羊附睪種布魯氏菌；電泳同時出現(xiàn)152bp、272bp、774bp、1071bp和1682bp5條條帶，為豬種布魯氏菌；電泳同時出現(xiàn)152bp、272bp、1071bp和1682bp4條條帶，為犬種布魯氏菌；電泳同時出現(xiàn)272bp、794bp、1071bp和1682bp4條條帶，為沙林鼠種布魯氏菌。結(jié)果判定：132血清學(xué)診斷RBT（虎紅平板凝集實驗）

SAT（試管凝集實驗）CFT（補體結(jié)合實驗）ELISA（酶聯(lián)聯(lián)免疫吸附實驗）FPA（熒光偏振實驗）2血清學(xué)診斷RBT（虎紅平板凝集實驗）14布魯氏菌誘導(dǎo)機體抗體曲線圖布魯氏菌誘導(dǎo)機體抗體曲線圖15

2.1RBT

簡便快捷，敏感性較高。

能夠檢測所有光滑型布魯氏菌的感染。

抑制IgM,檢測IgG1。等體積混合4分鐘，觀察到凝集現(xiàn)象。會產(chǎn)生假陽性與假陰性。2.1RBT16（1）技術(shù)要點：反應(yīng)條件要控制在室溫，3D搖晃4min后立即判讀（大量樣品操作時容易造成時間延誤）?；⒓t抗原要4°C冷藏，嚴禁冷凍保存。不能使用血漿樣本（容易產(chǎn)生假陽性）。在實驗過程中要加陰陽性對照。（1）技術(shù)要點：17（2）RBT抗原質(zhì)量控制

如果想得到更為可靠、準確使檢測結(jié)果，就要對檢測的各個環(huán)節(jié)進行質(zhì)量控制，使其標準化。

首先要對抗原進行質(zhì)控。（2）RBT抗原質(zhì)量控制18（3）RBT抗原質(zhì)控的方法當(dāng)新的一批抗原到來時，要對新的抗原進行質(zhì)控。簡述RBT抗原質(zhì)控方法如下（以O(shè)IE標準血清為例）：抗原滴度（可檢測性）：將OIEISS標準血清用生理鹽水稀釋為1：25,1：40,1：45,1：55和1：100。RBT實驗中當(dāng)血清在1

:45稀釋度時檢測為陽性，1

:55為檢測陰性則此項合格。如果超過了這個范圍則檢測度不合格。敏感性：取滴度略高于陰陽性臨界值的陽性血清，并用待檢抗原檢測，當(dāng)檢測結(jié)果均為陽性時則此項合格特異性：對陰性血清（通過未感然布魯氏菌動物的血液制備）進行檢測，檢測結(jié)果全為陰性則此項合格。純度/無菌性

（3）RBT抗原質(zhì)控的方法19

通過以上標準對抗原進行質(zhì)控至關(guān)重要。因為如果沒有良好質(zhì)控的話，則實驗中虎紅抗原可能會過于敏感（產(chǎn)生許多假陽性），或敏感性不夠（產(chǎn)生許多假陰性）。

當(dāng)沒有OIE標準血清時，需要使用國家標準血清對抗原進行質(zhì)控。國家標準血清符合OIE的要求，應(yīng)由國家參考實驗室提供。通過以上標準對抗原進行質(zhì)控至關(guān)重要。因為如果沒有良好質(zhì)控202.2SAT特異性抗體可與相應(yīng)的布氏菌抗原發(fā)生特異性結(jié)合，在電解質(zhì)的作用下，就會形成肉眼可見的凝集反應(yīng)，通過這種檢測來判斷，該動物是否為患病動物。2.2SAT21優(yōu)點：SAT主要檢查血清中的IgG和IgM。特異較好，實用性、敏感性較強。缺點：有前帶現(xiàn)象，有時出現(xiàn)假陰性結(jié)果。出結(jié)果慢，需要兩天。優(yōu)點：22實驗要點：

受檢血清應(yīng)新鮮、無溶血、無污染。

存放血清處溫度不能超過10℃，采血后應(yīng)于3-4日內(nèi)進行檢查，因放置時間過長可能會導(dǎo)致血清效價降低。個別血清會出現(xiàn)前帶現(xiàn)象，建議多做幾個管，多采用幾個稀釋度。實驗要點：232.3iELISA

間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（iELISA）是另一種對布病抗體敏感性較高的實驗。大概步驟如下，抗原包被在平板上，血清或奶樣中的特異性抗體能夠與抗原形成復(fù)合物。通過洗液洗滌去除未結(jié)合的抗體，當(dāng)用酶標二抗孵育顯色以后，可以通過index值來判斷動物是否為陽性。2.3iELISA24（1）實驗要點：要嚴格控制孵育時間和實驗溫度。洗滌步驟是最為關(guān)鍵的。要充分洗滌，拍干殘留液體，不要讓板子變干燥。奶樣要-20°C凍存，在4°C保存抗體滴度會降低。

實驗過程中，要加入陰陽性對照。（1）實驗要點：25（2）新進iELISA試劑盒的質(zhì)控：對不同檢測樣品都要進行一次質(zhì)控（血清，奶）包括以下幾個方面：可檢測性（OIE標準血清為例）：OIEELISAspISS1:16稀釋為陽性，1:64稀釋時為陰性。敏感性同RBT特異性同RBT可重復(fù)性（每種樣品要經(jīng)過多次重復(fù)（20次）并且在兩塊板子上進行檢測，來觀察產(chǎn)品的重復(fù)性是否良好）。（2）新進iELISA試劑盒的質(zhì)控：262.4CFT

補體結(jié)合實驗（CFT），是利用綿羊紅細胞與溶血素，補體組成溶血指示系統(tǒng)。當(dāng)布魯氏菌的特異性抗原、抗體復(fù)合物競爭結(jié)合指示系統(tǒng)中的補體時，溶血被抑制。因此可以通過抗溶血的程度來判斷抗體滴度與陰陽性。補體結(jié)合實驗主要檢查IgG類抗體，特異性強，準確性高，敏感性差，但是操作比較復(fù)雜，可以作為確診檢測。布病檢測方法及質(zhì)量控制ppt課件27在過去的實驗中主要通過凝集管進行檢測，費時費力廢材料。在接受ANSES培訓(xùn)以后，我們開始做微量CFT，用96孔板進行CFT實驗，大大地提高了檢測效率。在過去的實驗中主要通過凝集管進行檢測，費時費力廢材料。在28（1）CFT實驗步驟比較繁瑣，要注意以下的事項：采血5天后方能使用（讓紅細胞靜息）。每批溶血素需要測一次效價，每次實驗前要測補體效價。使用與測定補體效價同一批的紅細胞，溶血素來做主體實驗。待檢血清需滅活。加入對照（+，-,Ag,C,SRBCs）。（1）CFT實驗步驟比較繁瑣，要注意以下的事項：29（2）CFT抗原質(zhì)控質(zhì)控方法與RBT抗原相似可檢測性（OIE標準血清為例）：CFT抗抗原的質(zhì)控標準為，OIE標準血清200倍稀釋時產(chǎn)生50%的溶血抑制現(xiàn)象。敏感性同RBT特異性同RBT可重復(fù)性（2）CFT抗原質(zhì)控302.5FPA

熒光偏振免疫分析法(fluorescencepolarizationimmunoassay，F(xiàn)PA)是一種定量免疫分析技術(shù)

熒光物質(zhì)經(jīng)單一平面的藍偏振光(485nm)照射后，吸收光能躍入激發(fā)態(tài)，隨后回復(fù)至基態(tài)，并發(fā)出單一平面的偏振熒光(525nm)。

偏振熒光的強弱程度與熒光分子的大小呈正相關(guān)，與其受激發(fā)時轉(zhuǎn)動的速度呈反相關(guān)（如圖）。所以利用熒光素標記布魯氏菌的抗原，當(dāng)抗體與抗原形成復(fù)合物以后，轉(zhuǎn)動速度變慢，熒光強度增強。2.5FPA31陽性

陰性形成大的免疫復(fù)合物

未形成復(fù)合物，旋轉(zhuǎn)速度變慢

旋轉(zhuǎn)加快形成偏振光

不形成偏振光陽性陰性322.6血清學(xué)方法選擇的原則2.6血清學(xué)方法選擇的原則33

一般來說檢測方法的敏感性和特異性不可兼得，當(dāng)敏感性提高時，特異性就會降低，當(dāng)特異性提高時，敏感性會降低。因此在血清學(xué)檢測時，可以根據(jù)實際情況來選擇檢測方法?？梢酝ㄟ^敏感性較高又具備一定特異性的方法對樣品進行初篩，然后通過特異性較高的方法進行確診。從上圖中可以看出FPA、RBT、iELISA的敏感性較高，適合用作初篩實驗。而CFT、cELISA、SAT的敏感性不是很高但是特異性較強所以適合用作確診方法。綜上我們推薦使用以下檢測方法組合。一般來說檢測方法的敏感性和特異性不可兼得，當(dāng)敏感性提高34初篩：選擇RBT，因為它具有以下的特點：方便，便宜，敏感性強又兼具有一定的特異性。但是它對疫苗誘導(dǎo)抗體敏感。確診：SAT（OIE不推薦），CFT（便宜，特異性強，對疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體不是很敏感）。初篩：選擇RBT，因為它具有以下的特點：方便，便宜，敏感性強35

2.7其它方面的實驗室質(zhì)量控制（1）實驗室資源的質(zhì)控：

人員：要求人員充足，通過能力認證并可追溯，業(yè)務(wù)熟練（經(jīng)過內(nèi)部或外部培訓(xùn)），分工明確。儀器：經(jīng)過認證，校準，并且有定時檢查維護。如冰箱，生物安全柜，恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，移液器等。以移液器為例，需要按時對移液器進行校準。布病檢測方法及質(zhì)量控制ppt課件36

精確度低

精確度高

精準度高

精準度低精確度低精確度高37檢測步驟：要有標準化的實驗步驟，實驗條件，并編輯成冊。記錄檢測試劑信息：要及時記錄各種檢測試劑的信息（批號，生產(chǎn)日期等）。檢測結(jié)果記錄，驗證：要在實驗過程中對實驗結(jié)果進行記錄，需要第二個人對實驗結(jié)果進行驗證。表格：各種表格要完備，并要放在觸手可及的地方。檢測步驟：要有標