HCV分子生物學(xué)課件

HCV1、HCV生物學(xué)特征2、發(fā)病機理3、丙肝的診斷方法4、丙肝防治原則5、HCV傳播途徑HCV1、HCV生物學(xué)特征HCV生物學(xué)特征丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要由血液/體液傳播。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計，全球有1.7億人感染HCV。在我國健康人群抗HCV陽性率為0.7%~3.1%，約3800萬人。由于病毒生物學(xué)特點和宿主免疫功能等多方面因素，機體免疫往往難以有效清除病毒，致使約50%~80%HCV感染者發(fā)展為慢性肝炎，其中20%~30%將發(fā)展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1%~4%發(fā)展成為肝細胞癌癥。

HCV病毒體呈球形，直徑小于80nm（在肝細胞中為36～40nm，在血液中為36-62nm），為單股正鏈RNA病毒，在核衣殼外包繞含脂質(zhì)的囊膜，囊膜上有刺突。HCV僅有Huh7,Huh7.5,Huh7.5.1三種體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)，黑猩猩可感染HCV，但癥狀較輕。HCV生物學(xué)特征HCV生物學(xué)特征HCV生物學(xué)特征HCV分子生物學(xué)ppt課件HCV－RNA大約有9500－10000bp組成，5′3′非編碼區(qū)（NCR）分別有319-341bp，和27-55bp，含有幾個順向和反向重復(fù)序列，可能與基因復(fù)制有關(guān)。在5′非編碼區(qū)下游緊接一開放的閱讀框（ORF），其中基因組排列順序為5'-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能編碼一長3014個氨基酸的多聚蛋白前體，可經(jīng)宿主細胞和病毒自身蛋白酶作用后，裂解成各自獨立病毒蛋白，即三種結(jié)構(gòu)蛋白，核衣殼蛋白（或稱核心蛋白，C）和（E1），（E2/NS1）的糖蛋白，非結(jié)構(gòu)蛋白分別與NS2、NS3、NS4、NS5相對應(yīng)。由于GP72正好與瘟病毒表面蛋白或黃病毒第一個非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1）相對應(yīng)，故將GP72的基因標記稱謂E2/NS1。E1和E2/NS1糖蛋白能產(chǎn)生抗HCV的中和作用。NS2和NS4的功能還不清楚，發(fā)現(xiàn)與細胞膜緊密結(jié)合在一起。NS3蛋白具有螺旋酶活性，參與解旋HCV-RNA分子，以協(xié)助RNA復(fù)制，NS5有依賴于RNA的聚合酶活性，參與HCV基因組復(fù)制。HCV－RNA大約有9500－10000bp組成，5′3′非Ｅ１和Ｅ２是ＨＣＶ的包膜蛋白，其中Ｅ２對病毒的入胞過程很重要，它可以與宿主細胞因子ＣＤ８１和ＳＲ－ＢＩ結(jié)合，并可以逃避宿主免疫應(yīng)答。Ｅ１的作用還不是完全清楚，但

有研究發(fā)現(xiàn)Ｅ１對ＨＣＶ與細胞受體結(jié)合、膜融合過程起一個調(diào)節(jié)作用，也是抗病毒的一個潛在的靶點。Ｅ１和Ｅ２是ＨＣＶ的包膜蛋白，其中Ｅ２對病毒的入胞HCV變異性HCV具有顯著異源性和高度可變性，對已知全部基因組序列的HCV株進行分析比較其核苷酸和氨基酸序列存在較大差異。并表現(xiàn)HCV基因組各部位的變異程度不相一致，如5‘-NCR最保守，同源性在92-100%，而3′NCR區(qū)變異程度較高，在HCV的編碼基因中，C區(qū)最保守、非結(jié)構(gòu)（NS）區(qū)次之，編碼囊膜蛋白E2/NS1可變性最高稱為高可變區(qū)。丙肝病毒是RNA，RNA病毒的變異速度比DNA病毒快100萬倍，而且RNA病毒的外形也經(jīng)常改變，這就使得丙肝等RNA病毒的疫苗很難研制。HCV變異性HCV具有顯著異源性和高度可變性，對已知全部基因HCV基因分型①測序法：通過PCR擴增有代表性的基因片段（如5‘-UTR、C-E1和NS5B），再進行核苷酸序列測定，此為HCV基因分型的“金標準”。②型特異性引物擴增：根據(jù)不同HCV基因型在某一區(qū)段（主要是保守區(qū)）序列的差異，設(shè)計一系列型特異性引物，不同HCV基因型可擴增出長度大小不同的片段，并以此分型。③型特異性探針雜交法：通過將生物素或熒光素標記型特異性探針固相化在膜或芯片上，與實時定量（real-time,RT）-PCR擴增的病毒產(chǎn)物進行雜交后，經(jīng)掃描判讀出HCV基因型。用于該分型方法的區(qū)段是5‘-UTR及Core區(qū)。④基因芯片法：將許多特定的寡核苷酸片斷作為探針，有規(guī)律地排列固定于支持物上，然后與待測的標記樣品的基因按堿基配對原理進行雜交，再通過激光共聚焦熒光檢測系統(tǒng)對芯片進行掃描，并配以計算機系統(tǒng)對每一個探針上的熒光信號進行分析比較，從而迅速得出需要的信息。HCV基因分型①測序法：通過PCR擴增有代表性的基因片段（如HCV基因分型⑤限制性片段長度多態(tài)性法：利用限制性酶識別RT-PCR擴增的特定區(qū)域（5‘-UTR、C-E1和NS5B）的型特異的切割位點，將其分解為長短不同的若干片段以確定分型，該方法常用酶為HaeⅢ、RsaⅠ、MvaⅠ、HinfⅠ及ScrfⅠ，利用這些酶可分開6個基因型。對于病毒基因型而言，

與其他基因型相比，基因3型的CHC患者肝纖維化進展速度較快?，F(xiàn)知歐美國家多數(shù)HCV-Ⅰ型感染，而亞洲國家以Ⅱ型為主，Ⅲ型次之。Okomoto報告日本慢性丙型肝炎患者和健康獻血員主要為Ⅱ型感染，分別占59.3%和82.4%,而血友病人約50%為Ⅰ型感染,原因是應(yīng)用輸入美國進口凝因子Ⅷ。Wang氏報告我國北京慢性丙型肝炎患者86.2%為Ⅱ型感染,Ⅲ型感染為13.8%。而新疆病人Ⅲ型感染卻占50%,說明不同型HCV具有一定的地區(qū)和人群分布特征。此外不同基因型感染引起臨床過程和干擾素治療反應(yīng)亦表現(xiàn)不同,如Ⅲ型感染臨床癥狀較重,有引起嚴懲肝病傾向:Ⅱ型(Simmonds1b)感染對干擾素治療不敏感效果差。Ⅲ型感染(Simononds2a)用干擾素治療效果好。HCV基因分型⑤限制性片段長度多態(tài)性法：利用限制性酶識別RTHCV分布HCV分布1型全球分布1型全球分布2型全球分布2型全球分布3型全球分布3型全球分布4型全球分布4型全球分布5型全球分布5型全球分布6型全球分布6型全球分布7型全球分布7型全球分布HCV起源HCV起源HCV發(fā)病機理丙型肝炎發(fā)病機理仍未十分清楚，當HCV在肝細胞內(nèi)復(fù)制引起肝細胞結(jié)構(gòu)和功能改變或干擾肝細胞蛋白合成，可造成肝細胞變性壞死，表明HCV直接損害肝臟，導(dǎo)致發(fā)病起一定作用。但多數(shù)學(xué)者認為細胞免疫病理反應(yīng)可能起重要作用，發(fā)現(xiàn)丙型肝炎與乙型肝炎一樣，其組織浸潤細胞以CD3+為主，細胞毒T細胞（TC）特異攻擊HCV感染的靶細胞，可引起肝細胞損傷。丙型肝炎病毒感染是致病根本原因，在外界因素的影響下，如飲酒，勞累，長期服用有肝毒性的藥物等，可促進病情的發(fā)展。丙肝的病理改變與乙肝極為相似，以肝細胞壞死和淋巴細胞浸潤為主。慢性肝炎可出現(xiàn)匯管區(qū)纖維組織增生，嚴重者可以形成假小葉即成為肝硬化。HCV感染的發(fā)病機制主要包括免疫介導(dǎo)和HCV直接損傷兩種，病毒因素包括病毒的基因型、復(fù)制能力、病毒多肽的免疫原性等；宿主因素包括人體的先天性免疫反應(yīng)、體液免疫和細胞免疫反應(yīng)等。飲酒、免疫抑制劑的使用等因素對HCV的感染病程也有影響。HCV發(fā)病機理丙型肝炎發(fā)病機理仍未十分清楚，當HCV在肝細胞HCV病情發(fā)展HCV病情發(fā)展丙肝患者癥狀1.丙肝患者很大一部分沒有任何癥狀，慢性丙肝患者甚至可以在20年間沒有任何明顯癥狀。2.肝潛伏期一般為1.5-2個月，經(jīng)過一段時間的潛伏期后，便出現(xiàn)肝炎的常見癥狀，有疲乏、身體無力、食欲減退、部分可出現(xiàn)黃疸等癥狀。3.丙肝患者右上腹部感覺不舒服、惡心、嘔吐、食欲減退。4.少數(shù)丙肝患者伴低熱，輕度肝腫大，有些患者可出現(xiàn)黃疸。5.少數(shù)丙肝患者體重減輕、肌肉關(guān)節(jié)疼痛，睡眠不好。6.患者肝功能指標多為正?；蜉p度異常。丙肝患者癥狀1.丙肝患者很大一部分沒有任何癥狀，慢性丙肝患者動物模型1.黑猩猩【病理反應(yīng)最相似】2.樹鼩動物模型1.黑猩猩【病理反應(yīng)最相似】HCV侵入HCV侵入HCV分子生物學(xué)ppt課件HCV分子生物學(xué)ppt課件HCV檢測1.抗HCV[抗體]：多采用間接酶免疫法ELISA2.HCVcDNA/聚合酶鏈反應(yīng)測定肝和血清中HCVRNA：選用高度保守的5′非編碼區(qū)引物擴增放大后作電泳觀察結(jié)果。本法較靈敏。由于肝和血清中HCVRNA出現(xiàn)較抗-HCV為早，一些HCV感染者抗HCV尚未陽轉(zhuǎn)時，其肝和血清中已可測到HCVRNA。HCVRNA陽性，說明病毒在體內(nèi)復(fù)制；HCVRNA陰轉(zhuǎn)，說明病毒被清除。3.免疫組化法檢測肝組織中HCV抗原：感染HCV的黑猩猩或病人血清中提取lgG，用間接免疫熒光或間接免疫酶組化法檢測肝內(nèi)HCV抗原。HCV檢測1.抗HCV[抗體]：多采用間接酶免疫法ELISHCV-cAg、HCV-Ab、HCV-RNA三項聯(lián)合檢測已成為HCV感染的主要指標，可提高HCV感染“窗口期”的檢出率。由于廠家之間使用HCV基因重組抗原質(zhì)量及各抗原片段包被比例不同，各廠家試劑間的靈敏度和特異性存在一定差異，從而導(dǎo)致抗-HCV抗體檢測結(jié)果不一致。由于HCV感染后到抗體的形成需要1～15個月，存在窗口期（平均70天），所以HCV-Ab陰性并不能排除攜帶HCV病毒并具有傳染性的可能，而且尚有1%～3%的患者HCV-Ab可持續(xù)陰性，容易造成漏檢。HCV-RNA定量檢測靈敏度高，人在感染HCV后1～2周，血清中即可檢測到，可反映病毒的復(fù)制情況與傳染性，用于抗病毒治療的選擇和療效監(jiān)測，是診斷HCV的“金標準”。HCV-RNA檢測具有早期、敏感和特異等優(yōu)點，但HCV-RNA檢測影響因素較多，RNA容易降解，易出現(xiàn)假陰性，抽血后必須盡快分離低溫冷凍保存，所有器材必須高壓滅菌，不適合臨床樣本常規(guī)篩查。HCV-cAg檢測可將HCV檢測的窗口期縮短至15天。HCV核心抗原存在時間僅有27~70d，延長難度大，因而HCV核心抗原測定仍不能脫離抗-HCV檢測結(jié)果而單獨進行。HCV核心區(qū)基因變異與HCV核心抗原檢測結(jié)果有直接而復(fù)雜的聯(lián)系，抗原檢測敏感度并非一成不變。因而，對當前推廣的試劑盒進行改良，就需要著重提升單克隆抗體的天然抗原構(gòu)象表位親和力。HCV-cAg、HCV-Ab、HCV-RNA三項聯(lián)合檢測已HCV核心抗原存在時間僅有27~70d，延長難度大，因而HCV核心抗原測定仍不能脫離抗-HCV檢測結(jié)果而單獨進行。HCV核心區(qū)基因變異與HCV核心抗原檢測結(jié)果有直接而復(fù)雜的聯(lián)系，抗原檢測敏感度并非一成不變。因而，對當前推廣的試劑盒進行改良，就需要著重提升單克隆抗體的天然抗原構(gòu)象表位親和力。相對成熟的成果是HCV核心抗原和外周蛋白抗體及部分核心抗體相結(jié)合的檢測試劑盒。HCV核心抗原是HCV感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標，幾乎與HCV-RNA同時出現(xiàn)，這體現(xiàn)了核心抗原和HCV-RNA的動力學(xué)變化密切相關(guān)。HCV檢驗技術(shù)主要有HCV抗原檢測技術(shù)、HCV-RNA核算擴增檢測技術(shù)、抗-HCV檢測以及HCV核心抗原和抗-HCV檢測共4種類型。①HCV-RNA陰性，HCV-Ab、HCV-cAg陽性，表示丙肝病毒感染早期，而丙肝抗原沒有被抗體完全結(jié)合，抗原抗體同時陽性，HCV-RNA＜1×103U/ml或RNA樣本降解，有傳染性；②HCVRNA、HCV-cAg陰性，HCV-Ab陽性，表示丙肝病毒感染后病毒已清除（自愈或治愈）；③3項指標均陽性，表示慢性丙肝病毒感染，有傳染性；④HCV-RNA、HCVAb陰性，HCV-cAg陽性，表示早期丙肝病毒感染，HCVRNA＜1×103U/ml或RNA樣本降解，有傳染性；⑤HCV-RNA、HCV-Ab陽性，HCV-cAg陰性，表示丙肝病毒感染至少70天以后，慢性丙肝病毒感染，有傳染性；⑥HCV-RNA陽性，HCV-Ab、HCV-cAg陰性，表示血液中HCV抗原滴度未達到試劑檢測靈敏度，但HCV-RNA陽性表示有病毒感染，有傳染性。HCV核心抗原存在時間僅有27~70d，延長難度大，傳播途徑1、輸血及血制品曾是最主要的傳播途徑，常見的血液透析，輸血等。國內(nèi)曾單采血漿回輸血細胞時污染，造成丙型肝炎暴發(fā)流行，輸血后肝炎70%以上丙型肝炎，隨著篩查方法的改善，此傳播方式已得到明顯控制，但抗HCV陰性的HCV攜帶供血員尚不能篩除，輸血仍又傳播丙型肝炎的可能，特別是反復(fù)輸血及血制品者。

2、非輸血途徑傳播。【吸毒】此途徑主要為反復(fù)注射、針刺、含HCV血液反復(fù)污染皮膚黏膜隱性傷口及性接觸等其他密切接觸方式而傳播，這是散發(fā)性丙肝傳播的途徑。

3、母嬰傳播。HCV陽性母親傳播給新生兒的危險率為2%，分娩時陽性則高達4%-7%；合并HIV感染；幾率增至20%。4、性傳播。精液和陰道分泌物中也可以檢測到少量HCV,但實驗證明，母嬰的直系傳播以及性傳播的幾率非常小。傳播途徑1、輸血及血制品曾是最主要的傳播途徑，常見的血液透析丙肝防治原則丙型肝炎的預(yù)防方法基本與乙型肝炎的相同。目前，我國預(yù)防丙型肝炎的重點應(yīng)放在對獻血員的管理，加強消毒隔離制度，防止醫(yī)源性傳播。國外報告，對獻血員進行抗HCV篩查，可排除85%具有HCV傳染性的獻血員，從而明顯降低輸血后丙型肝炎的發(fā)病率。由于獻血員抗HCV陽性率與ALT水平和抗-HBc