外源基因表達(dá)機(jī)制課件

外源基因的表達(dá)基因表達(dá)技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)之一．外源基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)包括轉(zhuǎn)錄和翻譯兩個(gè)環(huán)節(jié)，它是在一系列酶蛋白和調(diào)控序列的共同作用下完成的．＊原核生物基因表達(dá)系統(tǒng)＊酵母基因表達(dá)系統(tǒng)＊植物基因表達(dá)系統(tǒng)＊?jiǎng)游锘虮磉_(dá)系統(tǒng)外源基因的表達(dá)基因表達(dá)技術(shù)是基因工程的核心技術(shù)之一．外源基因第一節(jié)基因表達(dá)機(jī)理外源基因的起始轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)錄起始的速率是基因表達(dá)的限速步驟.選擇可調(diào)控的啟動(dòng)子和相關(guān)的調(diào)控序列.啟動(dòng)子在細(xì)胞生長的初期不表達(dá)或低水平表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定的密度后開始高效表達(dá)．

第一節(jié)基因表達(dá)機(jī)理外源基因的起始轉(zhuǎn)錄原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)子一般比較簡單，可分為兩大類：誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和組成型啟動(dòng)子，前者如lac、trp、λPR、λPL、tac等的啟動(dòng)子，后者如T7噬菌體的啟動(dòng)子．外源基因在真核生物中的起始轉(zhuǎn)錄和表達(dá)相對(duì)復(fù)雜，啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列是外源基因在真核細(xì)胞中表達(dá)所必需的．真核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)子也可分為誘導(dǎo)型和組成型等類型.原核生物基因表達(dá)的啟動(dòng)子一般比較簡單，可分為兩大類：誘導(dǎo)型啟2mRNA的延伸與穩(wěn)定性1)mRNA的延伸

衰減子位點(diǎn)（attenuators）：類似于簡單的終止子，在原核生物中一般位于操縱子的啟動(dòng)子與第一個(gè)結(jié)構(gòu)基因之間．在構(gòu)建表達(dá)載體時(shí)要盡量避免該序列的存在．抗終止的序列元件（antitermination）．Poly(A)摻入信號(hào)序列：AAUAAA2)mRNA的穩(wěn)定性

mRNA的穩(wěn)定性直接決定翻譯產(chǎn)物的多少．對(duì)原核細(xì)胞來說，最佳的方法是選擇一個(gè)RNase缺失的受體菌．對(duì)真核細(xì)胞來說，則需要考慮增加mRNA的正確加工，提高成熟mRNA的穩(wěn)定性．2mRNA的延伸與穩(wěn)定性1)mRNA的延伸3外源基因mRNA的有效翻譯1)原核生物外源基因mRNA有效翻譯基本原則*AUG（ATG）是首選的起始密碼子．*SD序列為與核糖體16SrRNA互補(bǔ)結(jié)合的位點(diǎn)，該序列至少含有AGGAGG序列中的的4個(gè)堿基．*SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離為3

9個(gè)堿基．*在翻譯起始區(qū)周圍的序列不易形成明顯的二級(jí)結(jié)構(gòu)．2)真核生物基因mRNA有效翻譯非翻譯區(qū)不存在SD序列，但絕大多數(shù)mRNA的起始序列都含有共同的序列5'-CCA（G）CCATGG-3'，如果改變這一序列，可使翻譯的起始效率大大降低．3外源基因mRNA的有效翻譯1)原核生物外源基因mRNA有4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性

外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在宿主細(xì)胞中穩(wěn)定積累而不被內(nèi)源蛋白水解酶所水解是基因有效表達(dá)的一個(gè)重要因素．蛋白質(zhì)水解是一個(gè)有選擇的、精細(xì)調(diào)控的過程，它會(huì)影響外源基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞中的積累．

＊構(gòu)建融合蛋白表達(dá)系統(tǒng)．＊構(gòu)建分泌蛋白表達(dá)系統(tǒng)．＊構(gòu)建包涵體表達(dá)系統(tǒng)．＊選擇蛋白水解酶基因缺陷型的受體系統(tǒng)4表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定性外源基因的表達(dá)產(chǎn)物能否在5目的基因沉默

基因沉默（genesilencing）是導(dǎo)致外源基因不能正常表達(dá)的重要因素．位置效應(yīng)基因沉默：基因在基因組中的位置對(duì)其表達(dá)的影響．在植物和動(dòng)物轉(zhuǎn)基因中，外源基因進(jìn)入細(xì)胞核中并整合到染色體DNA上，其整合的位點(diǎn)與基因的表達(dá)密切相關(guān)．轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默：在DNA水平上的基因調(diào)控，主要是由于啟動(dòng)子的甲基化或外源基因的異染色質(zhì)化而引起的．轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默：在RNA水平上的基因調(diào)控，比轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默更普遍．共抑制(cosuppression)是轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默的一種，指被整合的外源基因沉默的同時(shí)，與其同源的內(nèi)源DNA的表達(dá)也受到抑制．5目的基因沉默基因沉默（genesilencing）第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件1啟動(dòng)子

啟動(dòng)子（promoter）是一段提供RNA聚合酶識(shí)別和結(jié)合的DNA序列，它位于基因的上游．其長度因生物的種類而異，一般不超過200bp．一旦RNA聚合酶定位并結(jié)合到啟動(dòng)子序列上，即可啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄．啟動(dòng)子是基因表達(dá)調(diào)控的重要順式元件．

第二節(jié)基因表達(dá)的調(diào)控元件1啟動(dòng)子啟動(dòng)子特性序列特異性．在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保守的序列框，序列框中堿基的變化會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的滯后和轉(zhuǎn)錄速度的減慢．方向性．啟動(dòng)子是一種有方向性的順式調(diào)控元件，在正反兩種方向中只有一種具有啟動(dòng)功能．位置特性．啟動(dòng)子只能位于所啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄基因的上游或基因內(nèi)的前端，處于基因的下游或在基因的上游但離所要啟動(dòng)的基因太遠(yuǎn)，一般都不會(huì)起作用．種屬特異性．原核生物的不同種、屬，真核生物的不同組織都具有不同類型的啟動(dòng)子．啟動(dòng)子特性序列特異性．在啟動(dòng)子的DNA序列中，通常含有幾個(gè)保原核生物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。多數(shù)細(xì)菌啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)序列為CAT．Pribnow框。在距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游6bp處存在一個(gè)六聯(lián)體保守序列：TATAAT，由于中間的堿基位于轉(zhuǎn)錄的起始點(diǎn)上游的10bp處，又稱為-10序列區(qū)。少數(shù)Pribnow框中間堿基的位置在-9

-18之間變化。Sextama框。在轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)區(qū)的另一個(gè)六聯(lián)體保守序列位于距轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35bp處，通常稱為-35區(qū)，該保守序列為TTGACA，它是RNA聚合酶的識(shí)別位點(diǎn)。間隔區(qū)。間隔序列內(nèi)部無明顯的保守性，其序列的堿基組成對(duì)啟動(dòng)子的功能并不十分重要。但間隔序列的長度卻是影響啟動(dòng)子功能．原核生物啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。多數(shù)細(xì)菌啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始區(qū)序列為C真核生物啟動(dòng)子I型啟動(dòng)子。I型啟動(dòng)子所屬基因編碼的產(chǎn)物為rRNA前體，經(jīng)剪切加工后成為各種成熟的rRNA分子。Ⅱ型啟動(dòng)子。Ⅱ型啟動(dòng)子所屬的基因絕大多數(shù)為編碼蛋白質(zhì)。*啟動(dòng)子基本區(qū):轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)及鄰近的TATA框。*啟動(dòng)子輔助區(qū)由多個(gè)位置不定保守序列組成．*GC框:起始位點(diǎn)上游-100

-300位置GGGCGG序列．Ⅲ型啟動(dòng)子。*內(nèi)啟動(dòng)子:轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的下游，如tRNA和5sRNA

的啟動(dòng)子。*外啟動(dòng)子:轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游，如脊椎動(dòng)物U6

核小RNA和7SKRNA啟動(dòng)子，其結(jié)構(gòu)類似于真核生物Ⅱ型啟動(dòng)子。真核生物啟動(dòng)子I型啟動(dòng)子。I型啟動(dòng)子所屬基因編碼的產(chǎn)物為rR原核生物基因RNA轉(zhuǎn)錄的起始原核生物基因RNA轉(zhuǎn)錄的起始2增強(qiáng)子增強(qiáng)子（enhancer）是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性的DNA順式作用序列．增強(qiáng)子的結(jié)構(gòu)類似于啟動(dòng)子，由多個(gè)元件組成，每個(gè)元件可以與一種或多種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合．轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)通常含有多個(gè)自主的增強(qiáng)子，每個(gè)長50

1500bp不等．每個(gè)增強(qiáng)子都有一種特定的功能．

2增強(qiáng)子增強(qiáng)子（enhancer）是能夠增強(qiáng)啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)子的一般特性雙向性．增強(qiáng)子的正反兩個(gè)方向都有調(diào)節(jié)活性．重復(fù)序列．增強(qiáng)子是一類相對(duì)較大的調(diào)控元件，一般都含有能獨(dú)立行使功能的重復(fù)序列．增強(qiáng)子行使功能與所處的位置無關(guān)．增強(qiáng)子可處于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的上游、下游，甚至處在轉(zhuǎn)錄序列之中．它們離被調(diào)控的序列可達(dá)數(shù)千個(gè)堿基對(duì)．特異性．少數(shù)增強(qiáng)子（如SV40增強(qiáng)子）能在所有類型的細(xì)胞中發(fā)揮作用，而大多數(shù)增強(qiáng)子行使功能時(shí)具有組織特異性，或在給定細(xì)胞的特定階段發(fā)揮作用．增強(qiáng)子不僅與同源基因相連時(shí)有調(diào)控功能，與異源基因相連時(shí)也有功能．增強(qiáng)子的一般特性雙向性．增強(qiáng)子的正反兩個(gè)方向都有調(diào)節(jié)活性．3終止子終止子（terminator）的功能不同于啟動(dòng)子和增強(qiáng)子，但它對(duì)基因的正常表達(dá)有重要意義．轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)后，RNA酶沿DNA鏈移動(dòng)，持續(xù)合成RNA鏈，直到遇到轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)．本征終止子：不需要其它蛋白輔助因子便可在特殊的

RNA結(jié)構(gòu)區(qū)內(nèi)實(shí)現(xiàn)終止作用．依賴終止信號(hào)的終止子則要依賴專一的蛋白質(zhì)輔助因子（如ρ因子）．即發(fā)夾結(jié)構(gòu)和由6個(gè)U組成的尾部結(jié)構(gòu)，兩者均為轉(zhuǎn)錄終止所必需．依賴型終止子：在終止位點(diǎn)上游50

90bp區(qū)域具有一種普遍的結(jié)構(gòu)特征，即合成的RNA鏈含有豐富的C堿基，但G堿基的含量很低，該區(qū)域也是ρ因子識(shí)別位點(diǎn)．3終止子終止子（terminator）的功能不同于啟動(dòng)子和4衰減子

衰減子（attenuator）：基因表達(dá)調(diào)控的精細(xì)調(diào)節(jié)裝置，它利用了原核生物轉(zhuǎn)錄與翻譯相偶聯(lián)的特性，依賴自身巧妙的特征序列和相應(yīng)的RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，對(duì)基因轉(zhuǎn)錄進(jìn)行開關(guān)式的微調(diào)作用，從而保證原核生物在相關(guān)操縱子處于阻遏的狀態(tài)下仍能以一個(gè)基底水平合成氨基酸、核苷酸和抗生素等．4衰減子衰減子（attenuator）：基因表達(dá)調(diào)控的精5絕緣子*絕緣子（insulator）：在真核生物基因組中，既是基因表達(dá)的調(diào)控元件，也是一種邊界元件．在果蠅和雞的基因組中已發(fā)現(xiàn)多個(gè)絕緣子，它能阻止臨近的調(diào)控元件對(duì)其所界定基因的啟動(dòng)子起增強(qiáng)或抑制作用．*果蠅中絕緣子SCS和SCS’分別位于果蠅多線染色體87A7座位hsp70基因兩側(cè)的核酸酶高度敏感區(qū)，它們是一種具有順式調(diào)控作用的邊界元件，能使其界定的染色體結(jié)構(gòu)域上的基因免受區(qū)域外兩端正調(diào)控和負(fù)調(diào)控信號(hào)的影響．5絕緣子*絕緣子（insulator）：在真核生物基因組6反義子

反義RNA（antisenseRNA）是一類與特定DNA序列互補(bǔ)的小分子RNA．編碼反義RNA的DNA稱為反義子．反義RNA廣泛存在于原核生物和真核生物中，它在DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯三個(gè)水平對(duì)基因的表達(dá)起著調(diào)節(jié)作用，其中以對(duì)蛋白質(zhì)合成的抑制最為普遍．6反義子反義RNA的調(diào)控作用反義RNA可以通過直接抑制和間接抑制兩種方式調(diào)節(jié)DNA的復(fù)制．反義RNA與引物RNA前體互補(bǔ)，使引物RNA無法與DNA模板結(jié)合，進(jìn)而抑制DNA復(fù)制的頻率．另一方面，反義RNA還可通過阻斷復(fù)制激活蛋白因子的合成而間接抑制DNA的復(fù)制．在轉(zhuǎn)錄水平上，反義RNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控是多形式的．反義RNA可通過與mRNA的5‘端互補(bǔ)結(jié)合而阻止轉(zhuǎn)錄的延伸；或作用于mRNA的polyA區(qū)域，抑制mRNA的成熟及其運(yùn)輸；或與真核生物mRNA結(jié)合影響其剪切和加工．反義RNA對(duì)mRNA翻譯的調(diào)控主要有兩種方式：通過與mRNA的5'端SD序列結(jié)合；或通過與mRNA的5'端編碼區(qū)（如起始密碼）結(jié)合，直接抑制翻譯的起始．反義RNA的調(diào)控作用反義RNA可以通過直接抑制和間接抑制兩種第三節(jié)基因表達(dá)系統(tǒng)*基因克隆的最終目的是實(shí)現(xiàn)目的基因在受體細(xì)胞中的表達(dá)．根據(jù)表達(dá)系統(tǒng)的受體細(xì)胞的不同，可分為四類：原核生物表達(dá)系統(tǒng)，酵母表達(dá)系統(tǒng)，植物表達(dá)系統(tǒng)和動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng).*目前利用的表達(dá)系統(tǒng)主要為原核生物表達(dá)系統(tǒng)和酵母表達(dá)系統(tǒng)．第三節(jié)基因表達(dá)系統(tǒng)*基因克隆的最終目的是實(shí)現(xiàn)目的基因在1原核生物表達(dá)系統(tǒng)1.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)1）外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的要素

a）強(qiáng)啟動(dòng)子：決定轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率

b）強(qiáng)終止子：決定轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的均一性

c）SD序列：決定mRNA的翻譯起始效率

d）密碼子：不同生物體的基因?qū)啿⒚艽a子的選擇具有偏愛

e）質(zhì)粒的拷貝數(shù)：mRNA的含量1原核生物表達(dá)系統(tǒng)1.1大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)2）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的策略外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)會(huì)造成異源蛋白在細(xì)胞內(nèi)大量積累，而異源蛋白易被細(xì)胞內(nèi)的酶所降解．其主要原因是：*大腸桿菌缺乏針對(duì)異源重組蛋白的折疊復(fù)性和翻譯后加工系統(tǒng)*不具備真核生物細(xì)胞完善的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)及眾多基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定因子*高效表達(dá)的異源重組蛋白在細(xì)胞內(nèi)形成高濃度微環(huán)境，增強(qiáng)蛋白分子相互作用2）大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建的策略外源基因在大腸桿菌中的高表達(dá)會(huì)A）構(gòu)建表達(dá)包涵體型異源蛋白

包涵體：某種生物大分子（蛋白質(zhì)）在細(xì)胞中累積，致密地積聚在細(xì)胞內(nèi)或被膜包裹或形成無膜裸露的結(jié)構(gòu)．結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：具有正確的氨基酸序列，但空間結(jié)構(gòu)是錯(cuò)誤的．優(yōu)點(diǎn)：簡化了外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化程序．包涵體密度大，水溶性低A）構(gòu)建表達(dá)包涵體型異源蛋白影響包含體形成的因素*溫度：較低培養(yǎng)溫度有利于形成包含體．*表達(dá)水平：過量表達(dá)有利于形成包含體．*細(xì)菌遺傳性狀：大腸桿菌染色體上與熱休克蛋白有關(guān)的基因失活有利于形成包含體．*異源蛋白質(zhì)的氨基酸序列：突變體比天然蛋白更易形成包含體．影響包含體形成的因素*溫度：較低培養(yǎng)溫度有利于形成包含體B）構(gòu)建重組異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)將SD序列和啟動(dòng)子安裝在外源基因的5’端ATG堿基前的正確位置，使外源基因高效表達(dá)序列正確的天然蛋白．C）構(gòu)建分泌型異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)將分泌型蛋白的信號(hào)肽編碼序列與外源基因拼接，使異源蛋白表達(dá)后分泌到細(xì)胞周質(zhì)中或直接進(jìn)入到培養(yǎng)基中．優(yōu)點(diǎn)：增大表達(dá)蛋白的穩(wěn)定性大大簡化后續(xù)的分離純化步驟．B）構(gòu)建重組異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)D）構(gòu)建融合型異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)異源蛋白與受體細(xì)胞自身蛋白以融合形式共表達(dá)．特點(diǎn)：受體菌蛋白與異源蛋白形成良好的雜合構(gòu)象，使得多肽鏈上的蛋白酶切位點(diǎn)隱藏在蛋白分子內(nèi)部而不易被切割，因而大大增加了產(chǎn)物的穩(wěn)定性D）構(gòu)建融合型異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)E）構(gòu)建寡聚型異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)通過外源基因多分子線性重組增加目的基因的拷貝數(shù)．

多表達(dá)單元型重組：外源基因均攜帶各自的啟動(dòng)子、終止子、SD序列及起始和終止密碼．翻譯起始信號(hào)，各單元方向可正可反．

多順反子型重組：外源基因含有各自的SD序列以及翻譯和終止信號(hào)，將它們串聯(lián)起來后克隆在一共同的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子下游，并安上一個(gè)共同的轉(zhuǎn)錄終止子．

多編碼序列型重組：多個(gè)外源基因序列串聯(lián)在一起，使用一套轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件．E）構(gòu)建寡聚型異源蛋白表達(dá)系統(tǒng)3)大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略優(yōu)化表達(dá)載體設(shè)計(jì)替換外源基因中的稀有密碼子提高外源mRNA的穩(wěn)定性提高基因表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性優(yōu)化發(fā)酵過程3)大腸桿菌中高效表達(dá)目的基因的策略優(yōu)化表達(dá)載體設(shè)計(jì)1.2芽孢桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，其作為外源基因表達(dá)系統(tǒng)具有如下優(yōu)點(diǎn)：*能將表達(dá)產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中，且在多數(shù)情況下，真核生物的異源重組蛋白經(jīng)芽孢桿菌分泌后，具有天然構(gòu)象和生物活性*在傳統(tǒng)發(fā)酵工業(yè)中廣泛應(yīng)用，無致病性*芽孢桿菌的遺傳背景清楚，生長快，培養(yǎng)條件簡單1.2芽孢桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)芽孢桿菌屬革蘭氏陽性菌，其作為外1.3藍(lán)藻基因表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)

＊基因組簡單，遺傳背景簡單＊細(xì)胞壁為G-，主要由肽聚糖組成．＊光能自養(yǎng)生長，培養(yǎng)條件簡單．＊含有多種內(nèi)源質(zhì)粒，便于構(gòu)建表達(dá)載體＊富含營養(yǎng)物質(zhì)（蛋白質(zhì)，維生素）1.3藍(lán)藻基因表達(dá)系統(tǒng)藍(lán)藻表達(dá)系統(tǒng)的特點(diǎn)2)藍(lán)藻表達(dá)載體

復(fù)制子：含有在大腸桿菌中起始復(fù)制的序列和藍(lán)藻中復(fù)制起始序列．啟動(dòng)子：可調(diào)控的啟動(dòng)子

*細(xì)菌基因表達(dá)啟動(dòng)子(nos)*嗜菌體基因表達(dá)啟動(dòng)子（PL,PR)

*金屬硫蛋白基因啟動(dòng)子*熱休克蛋白基因啟動(dòng)子*光誘導(dǎo)表達(dá)啟動(dòng)子選擇標(biāo)記基因2)藍(lán)藻表達(dá)載體復(fù)制子：含有在大腸桿菌中起始復(fù)制的序列3)藍(lán)藻細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因＊提高外源基因在藍(lán)藻中的拷貝數(shù)＊組裝含強(qiáng)啟動(dòng)子的外源基因表達(dá)盒＊以多種形式表達(dá)外源基因產(chǎn)物3)藍(lán)藻細(xì)胞中高效表達(dá)外源基因＊提高外源基因在藍(lán)藻中的拷貝2.酵母基因表達(dá)系統(tǒng)酵母菌是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖的單細(xì)胞真核生物，是理想的真核生物表達(dá)系統(tǒng)，具有以下特點(diǎn)：*基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理比較清楚，遺傳操作簡單.*具備真核生物蛋白翻譯后修飾加工系統(tǒng).*不含特異性病毒，不產(chǎn)生毒素，安全.*大規(guī)模發(fā)酵簡單，成本低廉.*能將外源基因表達(dá)的產(chǎn)物分泌到培養(yǎng)基中.2.酵母基因表達(dá)系統(tǒng)酵母菌是一類以芽殖或裂殖進(jìn)行無性繁殖的酵母基因表達(dá)載體酵母基因表達(dá)載體由酵母野生型質(zhì)粒，原核生物質(zhì)粒載體和酵母染色體的功能基因共同組成．DNA復(fù)制起始區(qū)：包括大腸桿菌中起始復(fù)制序列和酵母菌中起始復(fù)制的序列（2

質(zhì)粒復(fù)制起始序列，酵母基因組中自主復(fù)制序列）．選擇標(biāo)記基因：營養(yǎng)缺陷型選擇標(biāo)記和顯性選擇標(biāo)記（遺傳霉素G418,放線酮）.有絲分裂穩(wěn)定區(qū)：來源于酵母染色體著絲粒片斷．表達(dá)盒：由啟動(dòng)子，分泌信號(hào)序列（1730AA)，終止子等組成．酵母基因表達(dá)載體組成：*II型RNA聚合酶啟動(dòng)子．*雜合啟動(dòng)子：從已有的啟動(dòng)子中構(gòu)建．類型：*溫度調(diào)控型啟動(dòng)子．*超誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：加入誘導(dǎo)物時(shí)啟動(dòng)子活性成百上千倍地增加*嚴(yán)謹(jǐn)控制型啟動(dòng)子：啟動(dòng)子受某種因素的調(diào)節(jié)，使其表達(dá)控制在一定的水平上酵母菌啟動(dòng)子組成：*II型RNA聚合酶啟動(dòng)子．酵母菌啟動(dòng)子2)酵母基因表達(dá)載體的類型自主復(fù)制型質(zhì)粒載體：能夠在酵母細(xì)胞中進(jìn)行自我復(fù)制，但傳代過程中易于丟失．整合型質(zhì)粒載體：質(zhì)粒不含酵母DNA復(fù)制起始區(qū)，不能在酵母中進(jìn)行自主復(fù)制，含有整合雙臂．著絲粒型質(zhì)粒載體：含有自主復(fù)制序列和酵母染色體有絲分裂穩(wěn)定序列元件，能保持質(zhì)粒在細(xì)胞中穩(wěn)定性．酵母人工染色體：含有酵母染色體自主復(fù)制序列，著絲粒序列，端粒序列，酵母選擇標(biāo)記基因等，在細(xì)胞分裂過程中保持穩(wěn)定性．2)酵母基因表達(dá)載體的類型3）常用酵母菌表達(dá)系統(tǒng)A）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)(Saccharomycescerevisiae).B）乳酸克魯維酵母表達(dá)系統(tǒng)(Kluyveromyceslactis).C）巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)(Pichiapastoris)D）多型漢遜酵母表達(dá)系統(tǒng)(Hansenulapolymorpha)3）常用酵母菌表達(dá)系統(tǒng)A）釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)(Saccharo4)酵母中高效表達(dá)外源基因的策略

優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)．選擇合適的酵母受體系統(tǒng)．提高外源基因在細(xì)胞中的拷貝數(shù)．提高外源基因轉(zhuǎn)錄水平和在細(xì)胞中的穩(wěn)定性．4)酵母中高效表達(dá)外源基因的策略優(yōu)化表達(dá)載體的設(shè)計(jì)．3.植物基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)主要來自于原核生物，但真核生物基因與原核生物基因之間的結(jié)構(gòu)和表達(dá)調(diào)控存在很大差異．它包括轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后加工調(diào)控、轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控和翻譯調(diào)控。分子水平：真核生物基因組含量大，基因非連續(xù)，高度重復(fù)，堿基與氨基酸對(duì)應(yīng)的密碼間存在差異．細(xì)胞水平：轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和空間是相對(duì)獨(dú)立的，轉(zhuǎn)錄和翻譯后存在復(fù)雜加工過程個(gè)體水平：復(fù)雜的多細(xì)胞有機(jī)體，分化發(fā)育,存在不同程度的內(nèi)穩(wěn)態(tài)．3.植物基因表達(dá)系統(tǒng)對(duì)基因結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)主要來自于原核生物，但真1）植物基因表達(dá)載體系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒）啟動(dòng)子：＊組成型啟動(dòng)子：基因表達(dá)水平基本恒定在一定水平，在不同組織部位沒有明顯差異．如CaMV35S啟動(dòng)子．＊組織特異性啟動(dòng)子：基因表達(dá)在特定的組織或器官，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性．如花粉特異表達(dá)基因啟動(dòng)子（lat52).＊誘導(dǎo)型啟動(dòng)子：在某些特定的物理或化學(xué)信號(hào)刺激下可大幅度提高基因的轉(zhuǎn)錄水平．如光誘導(dǎo)啟動(dòng)子，熱誘導(dǎo)啟動(dòng)子，創(chuàng)傷誘導(dǎo)啟動(dòng)子．1）植物基因表達(dá)載體系統(tǒng)（Ti質(zhì)粒）啟動(dòng)子：終止子：不同來源終止子決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的穩(wěn)定性．T-DNA序列：是實(shí)現(xiàn)外源DNA與染色體DNA整合的功能單位．選擇標(biāo)記基因：通常為編碼正常植物中不存在的酶，并可與外源基因構(gòu)成嵌合基因，能在轉(zhuǎn)化體中有效表達(dá)且易于檢測(cè)和分析．如二氫葉酸還原酶基因(DHFR),潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(HPT)，Gus基因等．終止子：不同來源終止子決定外源基因的轉(zhuǎn)錄活性和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的2）克隆化基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控啟動(dòng)子的調(diào)控終止子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控激素對(duì)克隆化基因的調(diào)控2）克隆化基因在植物細(xì)胞中的表達(dá)調(diào)控啟動(dòng)子的調(diào)控3）克隆化基因的瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)

克隆化基因的瞬時(shí)表達(dá)：在合適的條件下，轉(zhuǎn)化的外源基因在數(shù)小時(shí)后就能檢測(cè)到其表達(dá)產(chǎn)物，在1-2d內(nèi)達(dá)到最高值，隨后又逐漸降低，至十多天后完全消失．*原理：未整合的外源基因以游離質(zhì)粒狀態(tài)表達(dá)或植物本身的調(diào)控作用使表達(dá)降低．克隆化基因的穩(wěn)定表達(dá)：克隆化基因整合到核基因組DNA上，并能穩(wěn)定遺傳和表達(dá)外源基因．3）克隆化基因的瞬時(shí)表達(dá)與穩(wěn)定表達(dá)克隆化基因的瞬時(shí)表達(dá)：4)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)構(gòu)建高效表達(dá)載體：選擇合適的啟動(dòng)子，組入完整的基因表達(dá)調(diào)控序列，合理插入內(nèi)含子，優(yōu)化先導(dǎo)序列提高翻譯效率．正確利用增強(qiáng)子：多數(shù)植物的增強(qiáng)子具有組織特異性．防止外源基因失活．4)外源基因在植物細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)4．克隆化基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)1)基因表達(dá)載體系統(tǒng)＊不帶真核復(fù)制子的質(zhì)粒型載體．如pTK2，克隆化基因整合到基因組中，在基因組的調(diào)控下低水平表達(dá)．＊帶真核病毒調(diào)控序列元件的質(zhì)粒表達(dá)載體(SV40衍生載體）．復(fù)制子：病毒基因組復(fù)制子．啟動(dòng)子：包括核心啟動(dòng)子和上游啟動(dòng)子，如病毒SV40基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和某些真核基因啟動(dòng)子．終止信號(hào)和加poly(A)信號(hào)．剪接信號(hào)：選擇標(biāo)記基因：胸苷激酶(tk)，二氫葉酸還原酶(DHFR)等.4．克隆化基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)1)基因表達(dá)載體系統(tǒng)2)轉(zhuǎn)基因的動(dòng)物受體細(xì)胞系統(tǒng)

*選擇來源豐富的起始受體細(xì)胞*建立動(dòng)物細(xì)胞