藤本豆秸稈發(fā)酵生產乙醇的工藝研究

精品文檔-下載后可編輯藤本豆秸稈發(fā)酵生產乙醇的工藝研究【摘要】目的：研究藤本豆秸稈被稀硫酸預處理后，經纖維素酶轉化，并利用混合菌發(fā)酵生產乙醇的工藝條件。方法：以吉林省九臺市郊當年產藤本豆秸稈為研究對象，用1.0%的稀硫酸預處理，用里氏木霉生產纖維素酶，在纖維素酶、熱帶假絲酵母、釀酒酵母共同作用下采用同步糖化共發(fā)酵法生產乙醇。結果纖維素酶生產的最適條件為：藤本豆秸稈由稀硫酸處理后，濾渣中添加適量營養(yǎng)，接入1.5×107～2.0×107個/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃固態(tài)培養(yǎng)7d。最適發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度30℃，發(fā)酵周期72h，轉速120r/min，纖維素酶用量40IU/g（對底物），熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%。在最適發(fā)酵條件下，乙醇產率為0.30g/g（乙醇/藤本豆秸稈），比其他試驗組產率都高。結論：藤本豆秸稈是價廉易得和來源豐富的可再生資源和能源，被纖維素酶轉化后可以生產乙醇部分替代石油。

【關鍵詞】藤本豆秸稈；纖維素酶；熱帶假絲酵母；釀酒酵母；乙醇

一、材料與方法

1.材料。藤本豆秸稈，取自吉林省九臺市郊，當年產。菌種：纖維素酶產生菌（TrichodermareeseiTJK108）、釀酒酵母（SaccharomycescerevisiaeSQY-002），由吉林工程技術師范學院食品工程學院實驗室保存。熱帶假絲酵母（Candidatropi

calis），購于中國菌種保藏中心。液體種子培養(yǎng)基：YEPD培養(yǎng)基。發(fā)酵培養(yǎng)基：取一定量預處理后的藤本豆秸稈，冷卻后用30%的NH4HCO3調節(jié)pH=4.8，并于121℃下濕熱滅菌20min。

2.藤本豆秸稈生產乙醇的總工藝流程（圖1）。（1）藤本豆秸稈的預處理。采用稀硫酸預處理玉米秸稈，將玉米秸稈風干后磨碎，于75℃烘箱中烘一晝夜至水分含量恒定，與1.0%的稀硫酸按一定比例混合（固液比為1：10），121℃下蒸煮120min。（2）纖維素酶的生產―TrichodermareeseiTJK108的固態(tài)培養(yǎng)。采用固態(tài)發(fā)酵工藝。取預處理后的藤本豆秸稈，過濾，濾渣用水和丙酮洗至pH值呈中性，其主要成分為纖維素。添加0.2%KH2PO4，0.2%MgSO4?7H2O，3%（NH4）2SO4，0.2%吐溫-80，10%酒糟，調節(jié)pH值至4.8，含水量至70%，121℃滅菌60min，接入1.5×107～2.0×107個/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃培養(yǎng)，發(fā)酵7d。

（3）菌種活化與稀釋。從試管斜面上分別取熱帶假絲酵母和釀酒酵母，在YEPD液體培養(yǎng)基中活化（150r/min，30℃，18h）血球計數板計數，并稀釋至108個細胞/ml。（4）酵。向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加適量的纖維素酶，按10%（體積比，下同）的接種量接入一定比例的熱帶假絲酵母和釀酒酵母，根據影響發(fā)酵的條件進行發(fā)酵試驗，并選取乙醇產率（乙醇/藤本豆秸稈，g/g）作為測試指標。一是最佳溫度的確定。藤本豆秸稈在不同溫度下進行發(fā)酵（發(fā)酵周期為72h，轉速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳溫度。二是最佳時間的確定。藤本豆秸稈在不同時間下進行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，轉速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳時間。三是最佳轉速的確定。藤本豆秸稈在不同轉速下進行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，纖維素酶用量為40IU/g對底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳轉速。四是最佳纖維素酶用量的確定。藤本豆秸稈在不同纖維素酶用量下進行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉速為120r/min，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量為10%），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳纖維素酶用量。五是最佳酵母菌接種量的確定。藤本豆秸稈在不同酵母菌接種量下進行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉速為120r/min，纖維素酶用量為40I

U/g對底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳酵母菌接種量。六是最佳酵母菌接種比例的確定。藤本豆秸稈在不同酵母菌接種比例下進行發(fā)酵（發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵周期為72h，轉速為120r/min，纖維素酶用量為40IU/g對底物，酵母菌接種量為10%），分別測定乙醇產率，確定發(fā)酵的最佳酵母菌接種比例。（5）蒸餾。取100g發(fā)酵樣，加入200ml蒸餾水，緩慢蒸餾出100ml餾出液。

3.乙醇含量測定。采用氣相色譜法。

二、結果與分析

（一）稀硫酸預處理藤本豆秸稈的結果

采用稀硫酸預處理藤本豆秸稈，在主要成分中，半纖維素是第一個參與反應的，木聚糖部分解聚和溶解，然后水解成木糖（反應1），外源硫酸的存在對于木糖單體的形成尤為重要，若缺乏外源酸，就會形成木糖低聚物。該過程中，只有少量的纖維素發(fā)生水解反應生成葡萄糖，而木質素經歷了解聚作用，但在水或酸中維持不溶解狀態(tài)。稀硫酸處理后，溶液中主要是半纖維素分解得到的木糖等五碳糖，粉狀固體中主要含有已分離開的纖維素和木質素。正常條件下，纖維素的水解需要十分苛刻的條件，但是經稀硫酸處理，半纖維素水解、纖維素和木質素分離開后，可以大大增加纖維素的水解性，這時加入纖維素酶，纖維素酶先吸附到纖維素表面，然后其中的內切酶在葡聚糖鏈的隨機位點水解底物產生寡聚糖，外切酶從葡聚糖鏈的還原或非還原端進行水解產生纖維二糖，β-葡萄糖苷酶水解纖維素二糖為葡萄糖。這3類酶“協(xié)同作用”最終將纖維素降解為葡萄糖（反應2）。反應1（木聚糖的解聚反應）：（C5H8O4）n+H2O（C5H8O4）（n-1）+C5H10O5，反應2（在纖維素酶的作用下纖維素降解生成葡萄糖的反應）：（C6H12O6）nnC6H12O6。

（二）纖維素酶的生產情況

在TrichodermareeseiTJK108的固態(tài)培養(yǎng)期間，每天測定1次酶活力。酶活力隨時間的變化見表1。固態(tài)培養(yǎng)過程中各主要影響因素的變化見表2。由表1可知，發(fā)酵前期（0～2d），由于孢子要萌發(fā)成菌絲，故纖維素酶生成較慢，酶活較低；發(fā)酵中期（2～7d），孢子已完全萌發(fā)成菌絲，菌絲代謝旺盛，纖維素酶大量生成，酶活增長較快，酶活力在第7天時達到最高，為

333.4U/g底物；第8天以后再延長發(fā)酵時間，菌體老化，纖維素酶活力增長緩慢，呈下降趨勢?？梢?，纖維素酶產生菌（Tricho

dermareeseiTJK108）的固態(tài)培養(yǎng)時間以7d為最佳。

表1酶活力隨時間的變化

由表2可知，發(fā)酵第1天，纖維素、還原糖和培養(yǎng)基中的營養(yǎng)被消耗，菌體開始生長；2～4d，當菌體消耗30%左右還原糖后，其生長開始進入旺盛期，該階段為纖維素的主要消耗期，纖維素消耗了36%左右；4d后，纖維素的消耗開始減緩。產酶培養(yǎng)基初始pH值為4.8；0～2d，由于銨根離子被消耗，pH值迅速下降；2～4d，由于培養(yǎng)基中無機鹽金屬離子的緩沖作用，pH值基本維持在4.0左右；隨著纖維素酶的大量合成，到產酶末期，pH值迅速上升。纖維素酶主要是胞外酶。這表明隨著纖維素酶的合成，胞外蛋白質隨即開始形成。

（三）發(fā)酵溫度對乙醇產率的影響

由于藤本豆秸稈中含有47.2%的纖維素及20.6%的半纖維素，稀硫酸預處理藤本豆秸稈過程中半纖維素被水解成戊糖，主要為木糖，預處理纖維素再經纖維素酶酶解成纖維二糖繼而在葡萄糖苷酶的作用下生成葡萄糖。若溫度較低，纖維素酶解速率較低，且乙醇發(fā)酵過程中所需要的各種酶酶活較低，影響乙醇產率；溫度過高，發(fā)酵過程中所需要的一些酶會因此失活，也影響乙醇產率。該試驗采用混合菌種發(fā)酵使藤本豆秸稈水解成的葡萄糖及木糖均能發(fā)酵成乙醇。試驗中所采用的熱帶假絲酵母與釀酒酵母最適發(fā)酵溫度分別為30℃與31℃。有研究發(fā)現，當發(fā)酵溫度為32℃時乙醇產率較高。

（四）發(fā)酵時間對乙醇產率的影響

乙醇發(fā)酵需要一個合理的發(fā)酵周期，發(fā)酵時間的長短直接影響著乙醇產率的高低。在發(fā)酵前12h內，乙醇產率變化很??；從12h開始，乙醇產率迅速增加；當達到72h左右時，乙醇產率達到最大值；發(fā)酵72h以后，乙醇產率開始降低。分析造成這種現象的原因：在發(fā)酵初期，酵母以發(fā)酵醪中的糖分為碳源，酵母不斷代謝糖分發(fā)酵成乙醇；發(fā)酵一段時間后，發(fā)酵醪中的糖分含量減少，酵母可能開始利用自身的代謝產物乙醇為碳源來維持自身的生長和繁殖。所以，在利用該菌株生產乙醇過程中，應該盡量控制好發(fā)酵時間，當發(fā)酵達到72h時，就可終止發(fā)酵。

（五）轉速對乙醇產率的影響

纖維素酶解需要與底物充分接觸；一定的轉速能保證纖維素底物與纖維素酶充分接觸；此外，由于菌株熱帶假絲酵母一般在“限氧”條件下發(fā)酵，這是由酵母本身的代謝方式所決定的。酵母對木糖的代謝分別依賴于：木糖還原酶將木糖轉化為木糖醇；木糖醇脫氫酶將木糖醇轉化為木酮糖；木糖激酶將木酮糖轉化為5-磷酸木酮糖，后者再經3-磷酸甘油醛進入糖酵解途徑，在木糖醇轉化成木糖酮的過程中，需要有氧的參與。一定的轉速可提供該酵母發(fā)酵所需要的溶解氧，轉速過高，可能會使發(fā)酵生成的一部分乙醇揮發(fā)掉，而且轉速過高，發(fā)酵液中的溶解氧增加，還可能導致生成的乙醇氧化成醋酸等其他產物。該試驗的適宜轉速約為120r/min。

（六）纖維素酶用量對乙醇產率的影響

預處理的藤本豆秸稈經纖維素酶酶解成葡萄糖及纖維二糖，纖維素酶的用量直接決定著預處理玉米秸稈纖維素的最終水解情況及乙醇產率。纖維素酶最適作用條件為溫度50℃，pH=4.8，纖維素酶最適用量25IU/g。乙醇產率隨著纖維素酶量的增加而增加，當酶活力達到45IU/g時，乙醇產率最高。分析原因可能是50℃時，溫度太高，不適于酵母的生長代謝所致。因此，該試驗中發(fā)酵溫度較低為30℃。這個溫度對于纖維素酶解所需最適溫度要低，會使纖維素酶解速率降低，所以纖維素酶的用量要高一些，以提高纖維素酶解速率，最優(yōu)量為45IU/g。盡管45IU/g是最優(yōu)的酶量，但是使用如此高活力的纖維素酶，在經濟上是不合算的。當纖維素酶活力從40IU/g增加到45IU/g時，乙醇產率增加甚微。因此，選用40IU/g纖維素酶濃度較為合適。

（七）酵母菌接種量對乙醇產率的影響

酵母菌接種量對乙醇產率有一定的影響，接種量過低，菌體產生的生物量較少，發(fā)酵過程不充分，乙醇產率較低；接種量過高，增加了細胞的維持能需要，乙醇產率也無法積累到較高水平。接種量在10%時，乙醇產率最高。

（八）酵母菌接種比例對乙醇產率的影響

采用混合菌種發(fā)酵生產乙醇，2種菌的比例對乙醇產率有著一定的影響，熱帶假絲酵母既能發(fā)酵葡萄糖又能發(fā)酵木糖生產乙醇，但其發(fā)酵葡萄糖產乙醇能力較差，發(fā)酵木糖產乙醇能力較強，而釀酒酵母一般不能發(fā)酵木糖，但它能快速有效地發(fā)酵葡萄糖生產乙醇。采用混合菌種發(fā)酵就很好地解決了預處理藤本豆秸稈酶解生產乙醇的技術問題，同時由于纖維素酶解藤本豆秸稈是一個復雜的酶解過程，而預處理藤本豆秸稈水解液中木糖的含量很高，所以采用混合菌種發(fā)酵時具有較強發(fā)酵木糖能力的熱帶假絲酵母比例要高一些。熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比為2：1時，乙醇產率最高。

三、結論

植物纖維資源是地球上分布最廣、含量最大、品種最多、價格低廉且可再生時間短的有機資源之一，利用可再生的植物纖維資源生產燃料乙醇對于緩解能源危機具有重大意義。該試驗得到的纖維素酶生產的最適條件是：藤本豆秸稈由稀硫酸處理后，濾渣中添加適量營養(yǎng)，接入15×107～2.0×107個/g底物TrichodermareeseiTJK108孢子懸浮液，于30℃固態(tài)培養(yǎng)7d。發(fā)酵的最適條件為：發(fā)酵溫度31℃，發(fā)酵周期72h，轉速120r/min，纖維素酶用量40IU/g對底物，熱帶假絲酵母與釀酒酵母的接種比2：1，酵母菌接種量10%，在該條件下乙醇產率最高為0.30g/g。藤本豆秸稈生產乙醇是利用再生資源解決液體燃料的一個國際性大問題，不少國家已在多年以前就開展該項工作。但目前還沒有實現大規(guī)模工業(yè)化生產，主要是經濟方面的問題。因此，今后應開發(fā)預處理新技術，培育價廉高活力的新型纖維素酶及五碳糖和六碳糖同步發(fā)酵的新菌種，研發(fā)出流程短、效率高和能耗低的玉米秸稈生產乙醇新工藝，從而降低乙醇生產成本，這將是今后科研的主攻方向。

參考文獻

[1]鄭鴻雁，昌友權，孫秀娥等.多年生藤本豆蛋白對小鼠免疫功能的影響[J].食品科學.2022，2