免疫血清制備專家講座

試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)和要求了解影響機(jī)體免疫應(yīng)答強(qiáng)度原因;明確首次應(yīng)答和再次應(yīng)答抗體產(chǎn)生規(guī)律；制備牛血清白蛋白（BSA）抗血清；熟悉佐劑制備和動(dòng)物免疫慣用方法；了解抗體檢測(cè)慣用方法。免疫血清制備專家講座第1頁(yè)

在免疫學(xué)試驗(yàn)中,為制備抗體通常以抗原性物質(zhì)給動(dòng)物注射,經(jīng)一定時(shí)間后,動(dòng)物血清中可產(chǎn)生大量特異性抗體，這種含有特異性抗體血清稱免疫血清。

試驗(yàn)原理免疫血清制備專家講座第2頁(yè)免疫應(yīng)答影響原因

抗體產(chǎn)生通常與抗原質(zhì)和量、動(dòng)物種類以及接種路徑有親密關(guān)系。一、抗原分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)

1.分子量：分子量越大，免疫原性越強(qiáng)。2.化學(xué)組成及結(jié)構(gòu)（1）蛋白質(zhì)（2）多糖：含有免疫原性,較蛋白質(zhì)弱。（3）核酸：多無(wú)免疫原性。3.結(jié)構(gòu)復(fù)雜性4.分子構(gòu)象

5.易靠近性

6.物理狀態(tài)免疫血清制備專家講座第3頁(yè)二、宿主方面原因1.遺傳原因同種動(dòng)物不一樣品系及不一樣個(gè)體對(duì)同種抗原產(chǎn)生不一樣強(qiáng)度免疫應(yīng)答。2.其它原因年紀(jì)、性別與健康狀態(tài)。三、免疫原劑量及進(jìn)入路徑（1）劑量1）劑量不足或過(guò)多均不引發(fā)免疫應(yīng)答。2）重復(fù)進(jìn)入引發(fā)強(qiáng)免疫應(yīng)答。（2）路徑：皮內(nèi)、皮下、肌肉、靜脈、腹腔、呼吸道和口服免疫應(yīng)答水平依次降低。免疫血清制備專家講座第4頁(yè)抗體產(chǎn)生普通規(guī)律首次應(yīng)答和再次應(yīng)答規(guī)律。

抗體產(chǎn)生次序規(guī)律：IgM-IgG-IgA-IgD-IgE免疫血清制備專家講座第5頁(yè)免疫血清制備專家講座第6頁(yè)首次應(yīng)答和再次應(yīng)答抗體產(chǎn)生比較免疫血清制備專家講座第7頁(yè)試驗(yàn)方案免疫佐劑制備及動(dòng)物首次免疫（第一周）再次免疫及血清采集（第二周）血清采集及抗體檢測(cè)（第三周）W1W2W3未免疫血清采集再次免疫血清采集首次免疫血清采集首次免疫再次免疫免疫血清制備專家講座第8頁(yè)試驗(yàn)材料動(dòng)物：昆明鼠（每組一只），約20g／只?？乖?mg／ml牛血清白蛋白（BSA)佐劑：完全福氏佐劑。其它：

PBS、1ml塑料管（保留血清用），無(wú)菌小試管，棉簽，1ml注射器、12＃針頭等。免疫血清制備專家講座第9頁(yè)試驗(yàn)流程12只小鼠小鼠眼眶取血制備血清2只2只8只W1W3W2首次免疫（1只/組）再次免疫免疫血清制備專家講座第10頁(yè)1.5mlBSA1.5ml完全福氏佐劑攪拌完全乳化第一周試驗(yàn)步驟

1.抗原制備滴于水中經(jīng)久不散免疫血清制備專家講座第11頁(yè)

2.動(dòng)物免疫用1ml注射器12＃針頭吸出完全乳化抗原1ml；換4＃針頭雙后足墊和背部皮下接種，每處約10-20ul。(接種處先用碘酒、酒精消毒)將免疫后小鼠放回鼠籠。1ml注射器（內(nèi)有乳化好抗原）貼好標(biāo)簽，4℃保留下次用。第一周試驗(yàn)步驟免疫血清制備專家講座第12頁(yè)免疫血清制備專家講座第13頁(yè)3.采集陰性血清（每班2只）用無(wú)菌小試管搜集未免疫小鼠血（眼眶放血法），標(biāo)識(shí)后送準(zhǔn)備室；2,000rpm離心

10分鐘;吸收血清置1ml塑料管，做好標(biāo)識(shí);注意:老鼠斷頸椎處死后放到樓梯口紅桶第一周試驗(yàn)步驟免疫血清制備專家講座第14頁(yè)免疫血清制備專家講座第15頁(yè)免疫血清制備專家講座第16頁(yè)第二次課內(nèi)容免疫血清制備專家講座第17頁(yè)抗原抗體反應(yīng)抗原與抗體特異性結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物。物質(zhì)基礎(chǔ):1）抗原表位與抗體高變區(qū)間互補(bǔ)結(jié)合2）抗原表位與抗體高變區(qū)溝槽分子表面結(jié)合3）抗原抗體之間結(jié)協(xié)力4）親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體免疫血清制備專家講座第18頁(yè)抗原抗體結(jié)協(xié)力靜電引力（electrostaticforces）范德華引力:作用最?。╲anderWaalsinteractions）氫鍵:最具特異性（hydrogenbond）疏水作用力:作用最大（hydrophobicinteractions）抗原抗體結(jié)協(xié)力示意圖免疫血清制備專家講座第19頁(yè)抗原抗體親和力和親協(xié)力親和力：抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)抗原決定簇之間相適應(yīng)而存在著引力，是抗原抗體間固有結(jié)協(xié)力親協(xié)力：抗體結(jié)合部位與抗原表位之間結(jié)合強(qiáng)度免疫血清制備專家講座第20頁(yè)親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體抗原抗體結(jié)合后，使水化層表面電荷降低或消失，水化層變薄，電子云也消失，蛋白質(zhì)由親水膠體轉(zhuǎn)化為疏水膠體。如再加入電解質(zhì)，如NaCl，則深入使疏水膠體物相互靠攏，形成可見抗原抗體復(fù)合物。抗原(親水膠體)

抗體(親水膠體)抗原抗體復(fù)合物

(疏水膠體)電解質(zhì)可見反應(yīng)

+免疫血清制備專家講座第21頁(yè)抗原抗體反應(yīng)普通規(guī)律特異性與交叉反應(yīng)性；可逆性：表面結(jié)合，有可逆性；抗原抗體交叉反應(yīng)示意圖免疫血清制備專家講座第22頁(yè)適比性：適合百分比，反應(yīng)才可見；階段性：不可見可見反應(yīng)；條件依賴性：PH，溫度，電解質(zhì)?？乖贵w反應(yīng)百分比性示意圖免疫血清制備專家講座第23頁(yè)血清制備：取首次免疫后小鼠2只，采集血清(方法同上),標(biāo)識(shí)后凍存?zhèn)溆谩Ｔ俅蚊庖撸浩溆嘈∈笥诟骨缓捅巢科は伦⑸渖洗沃苽淙榛乖?，每鼠注?.5ml。第二周試驗(yàn)步驟免疫血清制備專家講座第24頁(yè)第三周試驗(yàn)步驟

血清制備：采集剩下小鼠血,將血置室