18種繡線菊引物的rapd分析

18種繡線菊引物的rapd分析

在薔薇科中，最古老的科學(xué)繡菊科是100多個(gè)，在中國有50多個(gè)，分布在各省。繡線菊屬(SpiraeaL.)是繡線菊亞科中最原始的屬,在系統(tǒng)進(jìn)化過程中,衍生出形態(tài)各異而親緣關(guān)系緊密的繡線菊種類,以致后代表型上極為相似而難以區(qū)分(Iizuka和Kudo2001,2003)。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的不斷發(fā)展,采用DNA指紋技術(shù)可鑒定表型上難以鑒別的種或品種(劉本英和成浩2007;佘花娣等2003),所以嘗試將DNA分子水平鑒定技術(shù)用于繡線菊資源遺傳分析、資源評價(jià)及(品)種間區(qū)分是有意義的。迄今僅見到部分繡線菊資源葉片表皮結(jié)構(gòu)、花粉形態(tài)特征、藥理成分分析與提取技術(shù)、DNA的提取方法及RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化的報(bào)道(Chen等2004;房慧旺等2008),而對繡線菊資源的遺傳特性分析則幾乎是空白。因此本文采用RAPD標(biāo)記手段在DNA水平上對18種繡線菊進(jìn)行了初步探討,根據(jù)RAPD圖譜的條帶特征賦值,借助我校自主研發(fā)的專用IDAnalysis1.0軟件的分析結(jié)果,為北方地區(qū)常見的18種繡線菊構(gòu)建了一套一一對應(yīng)的“分子身份證(molecularID)”,并將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記,從而為在分子水平上區(qū)分繡線菊種類提供參考資料,以期為系統(tǒng)深入研究進(jìn)行繡線菊種質(zhì)資源遺傳多樣性和親緣關(guān)系建立基礎(chǔ)。數(shù)據(jù)分析及結(jié)果試驗(yàn)所用的18種繡線菊(SpiraeaLinn.)取自黑龍江省森林植物園和本校設(shè)施園藝工程中心(表1)。用改良的CTAB法對基因組DNA進(jìn)行提取(管曉慶等2007),優(yōu)化RAPD反應(yīng)體系和反應(yīng)程序,確定最佳的20μL反應(yīng)體系為:10×Taq緩沖液2μL、TaqDNA聚合酶1U、dNTP0.15mmol·L根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳(何光源2007)的結(jié)果記錄清晰可重復(fù)的RAPD條帶。數(shù)據(jù)分析時(shí),對于同一引物的擴(kuò)增產(chǎn)物,遷移率相同的條帶記為1個(gè)位點(diǎn),有DNA擴(kuò)增帶(顯性)記為1,無帶記為0,強(qiáng)帶和可清晰分辨的弱帶賦值均為1,將RAPD擴(kuò)增結(jié)果轉(zhuǎn)化成0/1矩陣用于進(jìn)一步的分析。任一位點(diǎn)若有一個(gè)個(gè)體不同于其它個(gè)體即為一個(gè)多態(tài)性位點(diǎn),這些特異位點(diǎn)所組合的字符串就可以代表相應(yīng)品種的分子身份證(高運(yùn)來等2009)。18種繡線菊分子身份證建立采用本校自行研發(fā)的資源特征分析軟件(IDAnalysis1.0,軟件登記號2007SR11870)進(jìn)行分析。在紫外燈下從瓊脂糖凝膠上將目的片段切下,采用膠回收試劑盒進(jìn)行分離純化,回收純化后的片段經(jīng)過定量后,將片段克隆到pEASY-T3載體上,轉(zhuǎn)入到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中,提取質(zhì)粒,酶切驗(yàn)證為正確克隆后,在上海生物工程技術(shù)有限公司完成測序(何光源2007)。根據(jù)測得的序列,利用Primer5.0軟件,遵循引物設(shè)計(jì)規(guī)則設(shè)計(jì)一對17~25bpSCAR引物,在上海生物工程技術(shù)有限公司合成,據(jù)已優(yōu)化的RAPD反應(yīng)體系和程序,進(jìn)一步優(yōu)化和確定SCAR-PCR的反應(yīng)體系和程序,驗(yàn)證SCAR標(biāo)記與原對應(yīng)的RAPD標(biāo)記的擴(kuò)增結(jié)果是否一致。結(jié)果118分子身份證構(gòu)建植物種或品種的分子身份證可以分為2類:一類是含有特異位點(diǎn)的種或品種,可以依靠這樣的特異位點(diǎn)利用單一引物直接確定鑒定的種類;由于具有特異位點(diǎn)的種類較少,因此更多種類的區(qū)分只能以多個(gè)引物的位點(diǎn)組合加以區(qū)分,即用2條以上的引物組合的位點(diǎn)來區(qū)分種類,當(dāng)2條引物不能完全區(qū)分所有種類時(shí),還可以通過增加引物數(shù)對種類加以區(qū)分,直到把所有種類區(qū)分開為止。植物種或品種的分子身份證利用資源特征分析軟件IDAnalysis1.0分析獲得(高運(yùn)來等2009)。經(jīng)過軟件分析,10條引物共檢測出51個(gè)位點(diǎn),每個(gè)引物能檢測到的位點(diǎn)范圍為4~7個(gè),平均為5.1個(gè),僅用6條引物對應(yīng)的7個(gè)位點(diǎn)可將18種繡線菊完全區(qū)分開。這7個(gè)位點(diǎn)分別為y1-1、y5-5、y7-5、y8-3、y9-5、y10-2、y10-3。y1-1代表的是第1條引物的第1位點(diǎn),y5-5代表的是第5條引物的第5位點(diǎn),依此類推。6條引物的堿基序列見表2,并按照上述7個(gè)位點(diǎn)的先后順序繪出18種繡線菊的區(qū)分流程圖;根據(jù)不同引物和位點(diǎn)的匹配,用0、1數(shù)組的不同組合加以區(qū)分,建立了各個(gè)繡線菊的分子身份證(圖1、表3)。218花卉繡菊的rapp特定標(biāo)記如RAPD擴(kuò)增圖譜(圖2)所示,經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn),獲得三裂繡線菊和石棒繡線菊的特異分子標(biāo)記,分別記為SL3序列的同源性比較試驗(yàn)中共獲得2個(gè)RAPD特異片段,回收并對其測序,根據(jù)序列結(jié)果設(shè)計(jì)引物。將得到的序列在GenBank上做Blast分析,進(jìn)行同源性比較,未發(fā)現(xiàn)與GenBank中已有序列有較高同源性。根據(jù)其序列結(jié)果,設(shè)計(jì)2對SCAR引物,其序列如下。SL4scar標(biāo)記轉(zhuǎn)換采用材料與方法中描述的20μL反應(yīng)體系,反應(yīng)終止,將SLrapd標(biāo)記算法Moreno等(1996)根據(jù)RAPD標(biāo)記分析22個(gè)薔薇野生種,擴(kuò)增所得RAPD譜帶將這些種歸類到與它們的遺傳背景分類相同的類群內(nèi),而且表明RAPD技術(shù)是分析關(guān)系相近和關(guān)系較遠(yuǎn)種和品種的快捷、簡單和可靠的方法。Jan等(1999)用RAPD標(biāo)記分析119個(gè)薔薇植株,38個(gè)種,其中36個(gè)種包括了Eurosa亞屬的8個(gè)組,另2個(gè)種屬于Hesperhodos亞屬和Platyrhodon亞屬。采用RAPD標(biāo)記技術(shù),也可建立快速簡便的繡線菊實(shí)驗(yàn)室鑒定方法(干滟等2001;Vilanova等2001),但RAPD卻具有不夠穩(wěn)定和重復(fù)性不好的缺點(diǎn)(王斌等1999),Weeden等(1994)的研究表明RAPD標(biāo)記檢測誤差在5%~10%之間。Lahogue等(1998)認(rèn)為可將RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR-PCR標(biāo)記,從而增強(qiáng)所獲得的RAPD標(biāo)記的特異性。但SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)化的成功率很低(Mulut等2008),Horejsi等(1999)曾獲得75個(gè)RAPD標(biāo)記,其中只有48個(gè)(64%)成功地轉(zhuǎn)化成了SCAR標(biāo)記,而只有15%的SCAR標(biāo)記表現(xiàn)出了應(yīng)有的多態(tài)性。本文選擇穩(wěn)定表達(dá)的2條特異性條帶,對其進(jìn)行了純化、測序,然后設(shè)計(jì)引物進(jìn)行SCAR-PCR擴(kuò)增的結(jié)果顯示,SCAR標(biāo)記在繡線菊屬植物種質(zhì)資源鑒定方面有一定的潛在應(yīng)用前景,本文中的特異標(biāo)記SL以往對電泳圖譜的分析多用指紋圖譜的方法,指紋圖譜是能夠鑒別生