脂肪酶在動脈粥樣硬化藥物篩選中的應用

脂肪酶在動脈粥樣硬化藥物篩選中的應用

心血管疾病已成為現(xiàn)代社會的主要死亡原因?，F(xiàn)有的以脂肪酶為靶的篩選體系通常采用溶液化酶法苦丁茶是我國和東南亞各國重要的飲用茶之一,其正品來源是冬青屬植物苦丁茶冬青IlexkudingchaC.J.Tseng的葉本研究開發(fā)了一種基于中空纖維吸附靶酶的集成流體灌注系統(tǒng),并將酶靶篩選和生物模型活性評價相結(jié)合,用于苦丁茶總皂苷中活性化合物的快速發(fā)現(xiàn)。首先,利用中空纖維作為載體,建立基于中空纖維吸附靶酶的集成流體灌注系統(tǒng)。進而,對酶靶篩選的方法學進行考察,包括中空纖維對脂肪酶的吸附和溶劑洗脫條件。然后,采用優(yōu)化后的條件,對苦丁茶總皂苷中的脂肪酶抑制劑進行快速篩選。最后,通過脂肪酶抑制活性實驗和低密度脂蛋白聚集體(aggregatelowdensitylipoprotein,aggLDL)誘導泡沫細胞形成模型對活性成分進行驗證。本研究構(gòu)建的基于中空纖維吸附靶酶的集成流體灌注系統(tǒng)具有功能集成、傳質(zhì)速率快、操作步驟簡單、分析通量和效率更高、成本低廉等優(yōu)點,并且有望與色譜和質(zhì)譜系統(tǒng)在線聯(lián)用,快速發(fā)現(xiàn)中藥藥效物質(zhì)。蛋白鹽藻脂肪酶鹽析及抑制活性評價儀器與材料島津高效液相色譜(HPLC)分析系統(tǒng)(Shimadzu,日本),包括LC-20AT液相系統(tǒng)、SIL-20A自動進樣器、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱;PHD/ULTRA注射泵(HarvardApparatus,美國);OprettaCLS基于中空纖維的流體灌注系統(tǒng)的設計和制造剪取8段均為30cm的中空纖維,將纖維分別裝入8根等長的聚四氟乙烯套管內(nèi),注入無水乙醇清洗活化1h,70℃烘干。在內(nèi)有中空纖維的聚四氟乙烯套管一端安裝1mL注射器。以50mmol·L中空纖維對脂肪酶吸附條件優(yōu)化為了確定脂肪酶在中空纖維上吸附的最佳孵育時間,使用BCA蛋白定量法對灌流過程中溶液蛋白濃度隨時間變化進行測定。依上述方法將脂肪酶溶液灌流充滿中空纖維后,每20min取出蛋白溶液2.5μL,稀釋20倍測定其濃度,并補入蛋白溶液2.5μL繼續(xù)孵育,如此至第300min。得到的蛋白溶液樣本依BCA試劑盒要求檢測溶液中脂肪酶的濃度,繪制蛋白濃度-時間曲線,通過曲線兩端的蛋白濃度差計算脂肪酶在中空纖維上的吸附濃度。洗脫條件優(yōu)化將苦丁茶總皂苷粉末溶解于pH6.8的Tris-HCl中,得到0.8mg·mL高效液相色譜(HPLC)分析條件色譜柱為AgilentSB-AqC脂肪酶抑制活性驗證稱取4-硝基苯基棕櫚酸酯8mg,用TritonX-100溶液0.1mL完全潤濕后加入醋酸鈉4.0mg,超純水稀釋至50mL,沸水浴加熱溶解,制得底物溶液。配制不同濃度的苦丁茶皂苷,取苦丁茶皂苷溶液100μL與脂肪酶溶液(2mg·mL式(1)中,R抗動脈粥樣硬化活性成分的篩選THP-1細胞使用含有10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)于37℃、5%CO數(shù)據(jù)處理及分析所有數(shù)據(jù)均以結(jié)果1纖維流態(tài)切換如圖1a所示,基于中空纖維的集成流體灌注系統(tǒng)分為兩部分,即流體控制部分和中空纖維部分。流體控制部分通過注射泵精確輸送和控制流體,魯爾換向閥進行不同流體的切換。中空纖維部分將中空纖維裝載入聚四氟乙烯套管內(nèi),連續(xù)灌流系統(tǒng)的連接管道均為聚四氟乙烯(PTFE)材質(zhì),這種材質(zhì)具有高度的疏水性和低黏附性2洗脫溶劑的篩選首先優(yōu)化脂肪酶吸附條件。利用中空纖維材料本身固有的多孔結(jié)構(gòu),脂肪酶可以通過物理吸附的方式固著于中空纖維上。主要考察吸附時間,脂肪酶的吸附量通過對與中空纖維接觸前后的溶液態(tài)脂肪酶濃度變化進行評價,如圖2所示。蛋白濃度的測定使用BCA蛋白定量法實現(xiàn),其標準曲線如圖2a所示,標準曲線表達式為Y=0.00278X+0.03872,R2=0.9895。將濃度為2.0mg·mL接著優(yōu)化洗脫條件。選用的分析物為由本課題組制備的苦丁茶總皂苷提取物,具有良好的水溶性,可直接溶解于Tris-HCl緩沖液中,第一次吸附灌流后,使用Tris-HCl緩沖液灌流清洗一次即可將中空纖維上游離的皂苷洗凈。為了盡可能完全地將與脂肪酶結(jié)合的苦丁茶活性成分洗脫下來,同時減少中空纖維對活性成分的非特異性吸附,本實驗對文獻中常見的兩種洗脫溶劑50%甲醇和100%甲醇進行了對比。結(jié)果顯示,100%甲醇洗脫得到的主成分峰面積明顯大于50%甲醇。故選取100%甲醇作為后續(xù)實驗的洗脫溶劑。綜上所述,基于中空纖維吸附酶靶的方法學優(yōu)化條件如下:吸附時間為200min,洗脫溶劑為100%甲醇。3苦丁茶總皂苷的篩選苦丁茶是一種廣泛流行于亞洲地區(qū)的常見飲用茶。研究表明,苦丁茶具有顯著的抗動脈粥樣硬化、降脂、消肥作用,可以減少營養(yǎng)性肥胖大鼠皮下脂肪的堆積采用優(yōu)化后的條件,對苦丁茶總皂苷中脂肪酶抑制劑進行快速活性篩選。由于中空纖維的多孔結(jié)構(gòu)本身可非特異性吸附總皂苷混合物中的物質(zhì),因此本實驗設置了不加入脂肪酶的中空纖維作為對照組,用于排除非特異性吸附的干擾。實驗組和對照組的HPLC對比結(jié)果如圖3a所示;對比實驗組與對照組主成分峰面積(圖3b)可見,峰5、6在實驗組中的響應峰面積明顯高于對照組,二者具有顯著性差異,說明這兩種成分可能是與脂肪酶具有潛在結(jié)合的活性成分。通過與文獻及標準品比對,這兩種化合物分別被鑒定為苦丁茶皂苷C(KuC)和A(KuA)4基于pnpp的活性成分為驗證中空纖維篩選體系的可靠性,對兩種苦丁茶皂苷對脂肪酶的抑制活性進行評價。脂肪酶可水解4-硝基苯棕櫚酸酯(PNPP)產(chǎn)生4-硝基苯酚(PNP)和棕櫚酸,PNP在水溶液中顯黃色,在405nm有最大的光吸收,通過測定PNP在405nm處的光吸收即可換算得脂肪酶的活力本實驗進一步采用低密度脂蛋白聚集體(aggLDL)誘導泡沫細胞形成模型評價了兩種苦丁茶皂苷的抗動脈粥樣硬化活性。動脈粥樣硬化是一個多因素共同調(diào)節(jié)的復雜病理過程基于中空纖維吸附靶酶活性模型的活性成分驗證本研究為發(fā)現(xiàn)降脂和抗動脈粥樣硬化的活性化合物,構(gòu)建了基于中空纖維吸附靶酶的集成流體灌注系統(tǒng),系統(tǒng)分為流體控制部分和中空纖維部分。首先對酶靶篩選的方法學進行考察,優(yōu)化吸附時間為200min,洗脫溶劑為100%甲醇。接著采用優(yōu)化后的條件對苦丁茶總皂苷中的脂肪酶抑制劑進行篩選,發(fā)現(xiàn)兩種與脂肪酶結(jié)合的小分子化合物,即苦丁茶皂苷A和C。最后,通過生物活性模型進行了活性驗證,確認苦丁茶皂苷A和C具有脂肪酶抑制活性和抑制巨噬細胞吞噬aggLDL形成泡沫細胞的活性。與溶液酶法、化學固定法、中空纖