基于二代測序的枇杷染色體步移研究

基于二代測序的枇杷染色體步移研究

據(jù)報道，枇杷篩選計劃始于2011年。近年來，以IlluminaHiseq為代表的二代測序的價格逐年降低，目前通過二代測序技術獲得6G基因組數(shù)據(jù)量的價格已經(jīng)低于千元。二代測序的單個Reads有150bp，雙端測序時可以含蓋200～500bp的DNA區(qū)域（根據(jù)需要，建庫時可以選擇更長的片段測序），這使得通過Reads的匹配來實現(xiàn)染色體步移成為可能。針對大量的測序數(shù)據(jù)，目前已經(jīng)有一些工具可以使用，例如NCBI的Magicblast工具筆者對‘火炬’枇杷進行二代測序，獲得原始測序數(shù)據(jù)。首先使用Magicblast工具進行染色體步移，在此基礎上再使用生物信息學方法新開發(fā)了一款基于二代測序數(shù)據(jù)的啟動子序列快速挖掘的腳本程序，并對‘火炬’枇杷中8個基因的啟動子進行分離。最后通過PCR克隆和Sanger測序的方式進行驗證。在枇杷和其他未公布基因組的物種中，本研究有助于快速獲得相關基因的啟動子序列，提高實驗效率。1材料和方法1.1選擇適應性品種‘火炬’枇杷（Eriobotryajaponica‘Huoju’）為晚花耐寒品種，適合江浙滬地區(qū)種植。為了方便后續(xù)研究，選擇該品種為試驗材料，2018年4月采集幼嫩葉片，使用CTAB法提取基因組DNA1.2對所獲得的基因序列進行檢測Magicblast針對測序原始數(shù)據(jù)設計，所以包含CleanReads的fastq文件不需要額外處理，可以直接操作。使用Makeblastdb指令對需要檢索的基因序列前100bp進行建庫，在使用Magicblast主程序檢索測序獲得的CleanReads.fq，設置參數(shù)score為60?，F(xiàn)階段Magicblast并不能設置檢索到10個Reads后停止，只能等它運行完成?？梢允謩咏Y束，但無法知曉它已經(jīng)獲得幾個匹配的Reads。運行一次后，收集匹配的Reads，使用Seqman軟件進行裝配1.3pc機病毒提取fpsd本研究新開發(fā)的腳本程序需要對CleanReads進行預處理。共設計開發(fā)3個Perl腳本程序，分別為Fastqtofasta.pl,Readsformate.pl和Promoter＿Scan.pl。前兩者為Reads預處理腳本。所有腳本程序以及使用范例已經(jīng)上傳至百度云盤（鏈接：/s/13iB4RNom0IKjcF7aNzkLFQ，提取碼:gvnf）。Fastqtofasta.pl負責提取包含CleanReads的fastq文件里的序列信息形成fasta格式文件。Readsformate.pl從雙端測序的兩端Reads的序列文件中分別分離首尾的10bp序列建立索引文件，首部索引為其反向互補序列，后部索引為正常序列。每一對雙端測序Reads包含4個10bp的索引序列（圖1-A）。這樣Perl程序只需要先匹配10bp的序列，提前過濾不匹配的Reads，極大地提高了運行效率。由于需要遍歷整個測序數(shù)據(jù)，耗時很長，本研究中60GB數(shù)據(jù)耗時約7h。該腳本只需要執(zhí)行1次即可。1.4索引序列匹配Promoter＿Scan.pl為核心程序。它首先讀取目的基因的前100bp序列。按順序檢索每對Reads的4個10bp的索引序列，未匹配跳到下一個Reads。如果匹配，再次使用目的基因的前30bp序列（誘餌）和Reads進行匹配，再次匹配后觸發(fā)延伸指令，兩次匹配保證了準確性。在索引序列匹配過程中有兩種情況，左端或者右端Reads的后索引匹配（圖1-A），此時另一端Reads在下游，只能起校檢作用，本次延伸長度短。另一種情況為左端或者右端Reads的前索引匹配（圖1-B），前索引為反向互補序列，此時另一端Reads在上游，也進入拼接程序，中間未知部分使用N表示。本研究建庫時片段長度為200～500bp。兩端的Reads分別是150bp，所以中間部分為-100～200bp長度，平均為50bp。一輪拼接完成后，程序自動選擇新序列的前100bp進行檢索，直至延伸長度達到2000bp為止。從枇杷轉錄本中隨機挑選8個基因進行啟動子挖掘1.5pcr擴增測序根據(jù)步移結果設計引物（表1），使用PCR擴增獲得‘火炬’枇杷的啟動子序列進行驗證。PCR反應體系為20μL(10μLLATaqHSpremix,1μL上游引物，1μL下游引物，DNA樣品1μL，雙蒸水7μL）。PCR程序為：94℃5min;94℃30s,55℃30s,72℃2min30s,35個循環(huán)。通過電泳割膠回收產物。使用PromegapGEM-TEasy對PCR產物和PUC19載體進行連接，轉化到DH5α大腸桿菌，涂板挑選單克隆菌株送生工生物測序。使用Clustalx對預測和測序的序列進行比對2結果與分析2.1堿基數(shù)據(jù)獲得使用IlluminaHiseqXten測序儀進行二代基因組測序，過濾掉測序質量差的Reads后（0.07%），獲得2.06億對雙端150bp的Reads數(shù)據(jù)，共計61.77GB的堿基數(shù)據(jù)。測序數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至中國科學院BIGD數(shù)據(jù)庫（BIGDataCenter:CRR056810)(/gsa）。前人估測枇杷基因組大小為700MB，所以測序深度約為85倍（表2）。2.2前端100p序列的檢索使用CL15890.Contig2（細胞壁擴展蛋白EjEXP3）為測試基因，從枇杷轉錄本文庫中找到該基因的序列，使用前端100bp序列建立Magicblast文庫并進行檢索。測試的‘火炬’枇杷二代測序數(shù)據(jù)超過60GB，整個數(shù)據(jù)的完全檢索需要花費超過5h，所以運行0.5h后手動終止，獲得部分檢索結果。序列拼接后往前延伸，根據(jù)新序列建立新文庫，循環(huán)延伸直至啟動子區(qū)域超過2000bp。整個檢索過程總共獲得147個匹配Reads，拼接19次，耗時9.5h。2.3轉錄本的使用為了估測Promoter＿Scan所需要花費的時間，隨機挑選枇杷中8個基因進行測試。從轉錄組中獲得轉錄本，逐一使用Promoter＿Scan對每個基因的啟動子區(qū)域進行染色體步移。統(tǒng)計延伸長度達到2000bp所需要拼接的次數(shù)和耗時。結果顯示拼接次數(shù)需要9到14次，平均11.8次。耗時從15.2～28.4min，平均21.3min。表3說明通過Promoter＿Scan可以顯著提高實驗效率。2.48ejop3基因啟動子序列比對為了進一步驗證本研究中開發(fā)的方法，對拼接后的啟動子序列設計引物，通過克隆測序進行驗證。筆者首先對Magicblast,Promoter＿Scan和克隆測序后的EjEXP3基因（CL15890.Contig2）啟動子序列進行比對（圖2）。篇幅限制僅展示部分比對結果，除了Promoter＿Scan中含有一定的未知序列N外，其余序列高度一致。通過PCR方式擴增剩余7個基因，Sanger克隆測序結果與預測結果序列完全一致，說明Promoter＿Scan得出的結果可靠。3基于二代測序數(shù)據(jù)的啟動子序列獲取枇杷基因組測序相關數(shù)據(jù)尚未公布，想要獲得相關基因的啟動子序列很難，這也是很多研究團隊進行基因組測序的原因。傳統(tǒng)方法多基于PCR法的染色體步移或者通過已公布近源種基因組同源克隆獲得。染色體步移實驗過程繁瑣，風險大基于此，本研究基于二代測序數(shù)據(jù)使用了兩種方法來獲取啟動子序列。通過Magicblast檢索耗時很長，但獲得的匹配Reads很多，通過拼接可以校正一些不正確的堿基。Magicblast已經(jīng)模塊化，所以只能依據(jù)檢索結果進