重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化課件

重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化外源DNA與載體分子的連接即為DNA重組技術(shù)，重組的DNA分子式在DNA連接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中，將分別經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切的載體分子和外源DNA分子連接起來(lái)。將重組質(zhì)粒導(dǎo)入感受態(tài)細(xì)胞中，將轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以通過(guò)各種方法篩選出重組子，并可通過(guò)酶切電泳進(jìn)行重組子的鑒定。外源DNA與載體分子的連接即為DNA重組技術(shù)，重組的DNA分重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化課件感受態(tài)理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生理狀態(tài)。它決定于受體菌的遺傳特性，同時(shí)與菌齡、外界環(huán)境等因素有關(guān)。感受態(tài)理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞，使其處于最適攝取和容納外來(lái)DNA的生感受態(tài)細(xì)胞制備方法及原理目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCl2法，制備好的感受態(tài)細(xì)胞可以加入終濃度為15%的無(wú)菌甘油，-70℃可保存半年至一年。經(jīng)過(guò)CaCl2處理的細(xì)胞細(xì)胞膜通透性增加，允許外源DNA分子進(jìn)入。該方法簡(jiǎn)便、快速、穩(wěn)定將快速生長(zhǎng)的大腸桿菌置于經(jīng)低溫（0℃）預(yù)處理的低滲氯化鈣溶液中，便會(huì)造成細(xì)胞膨脹，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，感受態(tài)細(xì)胞制備方法及原理目前常用的感受態(tài)細(xì)胞制備方法有CaCCaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞CaCl2法制備感受態(tài)細(xì)胞影響因素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期試劑質(zhì)量：分析純雜菌和雜DNA污染：所用器皿、試劑均需滅菌溫度：冰上操作影響因素細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)：對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化是某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的細(xì)胞的DNA而使它的基因型和表型發(fā)生相應(yīng)變化的現(xiàn)象。在低溫下，將攜帶有外源DNA片段的載體與感受態(tài)細(xì)胞混合，經(jīng)過(guò)熱激或電穿孔技術(shù)，使載體分子進(jìn)入細(xì)胞。進(jìn)入受體細(xì)胞的外源DNA分子通過(guò)復(fù)制、表達(dá)，使受體細(xì)胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。將這些轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)，即可篩選出重組子。轉(zhuǎn)化是某一基因型的細(xì)胞從周圍介質(zhì)中吸收來(lái)自另一基因型的細(xì)胞的重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化課件轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。轉(zhuǎn)化過(guò)程所用的受體細(xì)胞一般是限制－修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不方法及原理熱激法：使用化學(xué)試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細(xì)胞，細(xì)胞膜通透性發(fā)生變化，極易與外源DNA相粘附并在細(xì)胞表面形成抗脫氧核糖核酸酶的羥基－磷酸鈣復(fù)合物。此時(shí)，將該體系轉(zhuǎn)移到42℃下做短暫的熱刺激（90s），細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生劇烈擾動(dòng)，并隨機(jī)出現(xiàn)許多間隙，外源DNA就可能被細(xì)胞吸收。方法及原理熱激法：使用化學(xué)試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細(xì)胞操作步驟取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍后馬上進(jìn)行下面的操作)，加入10μl重組質(zhì)粒DNA(體積不超過(guò)10μl)+100μl感受態(tài)細(xì)胞將以上樣品輕輕搖勻，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保溫1－2min，然后迅速冰上冷卻2min立即向上述管中分別加入LB液體培養(yǎng)基（不需在冰上操作），搖勻后于37℃振蕩培養(yǎng)約45-60min，使受體菌恢復(fù)正常生長(zhǎng)狀態(tài)，并使轉(zhuǎn)化體表達(dá)抗生素基因產(chǎn)物。操作步驟取100μl感受態(tài)細(xì)胞懸液(如是冷凍保存液，則需化凍提高轉(zhuǎn)化效率的方法感受態(tài)質(zhì)量質(zhì)粒DNA的相對(duì)分子質(zhì)量和濃度防止雜菌和雜DNA污染提高轉(zhuǎn)化效率的方法感受態(tài)質(zhì)量重組子的篩選轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可篩選出轉(zhuǎn)化子重組子的篩選轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞在篩選培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可篩選出轉(zhuǎn)化子藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。野生型大腸桿菌產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶可以將無(wú)色化合物X-gal切割成半乳糖和深藍(lán)色的物質(zhì)5-溴-4-靛藍(lán)。有色物質(zhì)可以使整個(gè)培養(yǎng)菌落產(chǎn)生顏色變化，而顏色變化是鑒定和篩選的最直觀有效的方法。藍(lán)白斑篩選藍(lán)白斑篩選是一種基因工程常用的重組菌篩選方法。野生篩選原理IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子，在含有X-gal的固體平板培養(yǎng)基中菌落呈現(xiàn)藍(lán)色。當(dāng)外源DNA（即目的片段）與含lacz'的載體連接時(shí)，會(huì)插入進(jìn)MCS（即靶基因），使α肽鏈讀碼框破壞，不產(chǎn)生活性β-半乳糖苷酶，即不可分解培養(yǎng)基中的X-gal產(chǎn)生藍(lán)色，培養(yǎng)表型即呈現(xiàn)白色菌落。篩選原理IPTG可以激活lacz'中的β-半乳糖苷酶的啟動(dòng)子通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MCS無(wú)插入時(shí)，互補(bǔ)，藍(lán)菌斑。MCS有插入時(shí)，不互補(bǔ)，白菌斑。IPTG誘導(dǎo)的結(jié)果：通過(guò)看培養(yǎng)皿上的菌斑的顏色就能直接知道是否有DNA插入。MC重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化課件無(wú)質(zhì)粒的受體菌

-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無(wú)抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)無(wú)菌斑生長(zhǎng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌

-半乳糖苷酶的缺失被載體產(chǎn)物

互補(bǔ)，能分解Xgal。且有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有藍(lán)色菌斑生長(zhǎng)帶外源DNA插入的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的受體菌載體產(chǎn)物失活，不能互補(bǔ)

-半乳糖苷酶的缺失。不能分解Xgal，但有抗菌素抗性在含抗菌素和Xgal的培養(yǎng)基上培養(yǎng)有白色菌斑生長(zhǎng)無(wú)質(zhì)粒的-半乳糖苷酶部分缺失，不能分解Xgal；無(wú)抗菌素抗抗生素抗性篩選實(shí)驗(yàn)中，通常藍(lán)白篩選是與抗性篩選一同使用的。含X-gal的平板培養(yǎng)基中同時(shí)含有一種或多種載體所攜帶抗性相對(duì)應(yīng)的抗生素，這樣，一次篩選可以判斷出：未轉(zhuǎn)化的菌不具有抗性，不生長(zhǎng)；轉(zhuǎn)化了空載體，即未重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成藍(lán)色菌落；轉(zhuǎn)化了重組質(zhì)粒的菌，長(zhǎng)成白色菌落?？股乜剐院Y選實(shí)驗(yàn)中，通常藍(lán)白篩選是與抗性篩選一同使用的。含轉(zhuǎn)基因技術(shù)什么是轉(zhuǎn)基因技術(shù)？1983年，世界上第一例轉(zhuǎn)基因植物在美國(guó)成功培植，當(dāng)時(shí)就曾有人驚呼：“人類開始有了一雙創(chuàng)造新生物的‘上帝之手’?！庇腥祟A(yù)言，21世紀(jì)將是轉(zhuǎn)基因作物的一個(gè)轉(zhuǎn)換期，科技含量將有很大的提高。轉(zhuǎn)基因技術(shù)什么是轉(zhuǎn)基因技術(shù)？轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，由于導(dǎo)入基因的表達(dá)，引起生物體的性狀的可遺傳的修飾。人們常說(shuō)的“遺傳工程”、“基因工程”、“遺傳轉(zhuǎn)化”均為轉(zhuǎn)基因的同義詞。轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是將人工分離和修飾過(guò)的基因?qū)氲缴矬w基因組中，基因工程和選擇性繁殖技術(shù)有什么不同轉(zhuǎn)基因技術(shù)與選擇性繁殖都會(huì)改變生物的基因。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)基因在不同物種之間的傳遞和流動(dòng)?？梢詫?shí)現(xiàn)物種間的基因轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)基因技術(shù)轉(zhuǎn)移的基因更明確，更有目的性。選擇性繁殖實(shí)驗(yàn)過(guò)程緩慢?；蚬こ碳夹g(shù)篩選優(yōu)良品種的周期更短，利用基因工程，可以很容易地進(jìn)行物種的雜交。23基因工程和選擇性繁殖技術(shù)有什么不同轉(zhuǎn)基因技術(shù)與選擇性繁殖都會(huì)“選擇性繁殖”技術(shù)24“選擇性繁殖”技術(shù)24植物轉(zhuǎn)基因方法直接基因轉(zhuǎn)移方法:基因槍法、PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表。生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法，其中農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法操作簡(jiǎn)便、成本低、轉(zhuǎn)化率高，廣泛應(yīng)用于雙子葉植物的遺傳轉(zhuǎn)化。植物轉(zhuǎn)基因方法直接基因轉(zhuǎn)移方法:基因槍法、PEG介導(dǎo)的原生2626花粉管通道

花粉管通道法是指在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過(guò)程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握?；ǚ酃芡ǖ阑ǚ酃芡ǖ婪ㄊ侵冈谑诜酆笙蜃臃孔⑸浜夏哭r(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)28農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)28感染轉(zhuǎn)化選擇轉(zhuǎn)基因植株評(píng)價(jià)與鑒定再生農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)29感染轉(zhuǎn)化選擇轉(zhuǎn)基因植株評(píng)價(jià)與鑒定再生農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)克隆是將一個(gè)體細(xì)胞的DNA移入一個(gè)已經(jīng)被去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，然后刺激這個(gè)改造后的卵細(xì)胞，使它開始分裂并成為一個(gè)胚胎，這個(gè)胚胎的基因與體細(xì)胞提供者的基因完全一樣。關(guān)于轉(zhuǎn)基因，通常因有性生殖造成同種生物個(gè)體之間遺傳物質(zhì)的重組.克隆是對(duì)單體的復(fù)制。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可以保持生物基因的多樣性，而克隆卻沒(méi)有什么幫助，反而有一定的威脅。30轉(zhuǎn)基因和克隆技術(shù)克隆是將一個(gè)體細(xì)胞的DNA移入一個(gè)已經(jīng)被去掉克隆羊“多莉”的產(chǎn)生過(guò)程克隆羊“多莉”的產(chǎn)生過(guò)程3232轉(zhuǎn)基因技術(shù)和傳統(tǒng)育種技術(shù)有什么區(qū)別本質(zhì)都是通過(guò)獲得優(yōu)良基因進(jìn)行遺傳改良?；蜣D(zhuǎn)移的范圍和效率上，兩者有兩點(diǎn)重要區(qū)別：第一，傳統(tǒng)技術(shù)一般只能在生物種內(nèi)個(gè)體間實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)基因技術(shù)所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關(guān)系的限制，就是說(shuō)可以打破種的限制。第二，傳統(tǒng)的雜交和選擇技術(shù)一般是在生物個(gè)體水平上進(jìn)行，操作對(duì)象是整個(gè)基因組，對(duì)后代的表現(xiàn)預(yù)見性較差。轉(zhuǎn)基因技術(shù)所操作和轉(zhuǎn)移的一般是經(jīng)過(guò)明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)可準(zhǔn)確預(yù)期。33轉(zhuǎn)基因技術(shù)和傳統(tǒng)育種技術(shù)有什么區(qū)別本質(zhì)都是通過(guò)獲得優(yōu)良基因進(jìn)轉(zhuǎn)基因食品以轉(zhuǎn)基因生物為原料加工生產(chǎn)的食品。根據(jù)原料來(lái)源：動(dòng)物源、植物源、微生物源根據(jù)功能：增產(chǎn)型、控熟型、高營(yíng)養(yǎng)型、保健型、新品種型、加工型最初目標(biāo)：保護(hù)作物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估：環(huán)境和人類健康

（1）對(duì)人類健康的直接影響（毒性）；（2）引起過(guò)敏反應(yīng)的趨勢(shì)（過(guò)敏性）；（3）被認(rèn)為有營(yíng)養(yǎng)特性或毒性的特殊成分；（4）插入基因的安全性；（5）與基因改良有關(guān)的營(yíng)養(yǎng)效果；（6）由基因插入產(chǎn)生的任何非預(yù)期影響。轉(zhuǎn)基因食品以轉(zhuǎn)基因生物為原料加工生產(chǎn)的食品。重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化課件基因產(chǎn)品的開發(fā)現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因食品的開發(fā)美國(guó)55%的大豆是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品，40%—50%玉米是經(jīng)過(guò)基因工程改變過(guò)的。美國(guó)超市上有4000多種食品含有轉(zhuǎn)基因成份。1996年，世界種植轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物的面積為700萬(wàn)公頃。到1999年增加到7500萬(wàn)公頃，美國(guó)占了74%，中國(guó)只占1%。2000年美國(guó)基因農(nóng)作物產(chǎn)品的銷售額達(dá)950億美元。植物基因工程源源創(chuàng)造新品種，轉(zhuǎn)基因食品的增長(zhǎng)是無(wú)限的，將不斷推進(jìn)經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)。36基因產(chǎn)品的開發(fā)現(xiàn)狀轉(zhuǎn)基因食品的開發(fā)36重組子的鑒定及基因表達(dá)產(chǎn)物的分析瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS核酸分子雜交重組子的鑒定及基因表達(dá)產(chǎn)物的分析瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。直接電泳檢測(cè)法從轉(zhuǎn)化后的菌體克隆中分離質(zhì)粒，電泳、比較其分子量。DNA電泳檢測(cè)法

Marker載體重組子利用有插入片段的重組載體的分子量比野生型載體分子量大。直接電根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子原理：有外源DNA片段插入載體后的重組DNA與載體DNA之間的大小差異?；痉椒ǎ禾崛∞D(zhuǎn)化子的DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離，電泳遷移慢的帶是重組DNA的帶。此法是對(duì)重組子進(jìn)行分析鑒定的最基本、最簡(jiǎn)單的方法，只適用于重組子的初步鑒定。根據(jù)重組DNA分子大小鑒定重組子聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在聚丙烯酰胺凝膠介質(zhì)中向正極移動(dòng)，移動(dòng)的速率主要取決于其分子量大?。ㄦ湹拈L(zhǎng)短），從而把不同分子量的肽鏈分開。電泳buffer電泳buffer聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）：在電場(chǎng)的作用下線性蛋白質(zhì)鏈在點(diǎn)樣電泳方向點(diǎn)樣電泳方向DaltonDalton凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：靈敏度底、只能檢出>0.3-1μg/帶，但可褪色回收。硝酸銀：靈敏度高、可檢出2-5ng/帶。2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色。1）直接染色凝膠中的蛋白質(zhì)染色：考馬斯亮藍(lán)：硝酸銀：2）轉(zhuǎn)到膜上進(jìn)行染色直接染色電泳結(jié)果直接染色電泳結(jié)果

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則退火形成雙鏈的過(guò)程。雜交的雙方是待測(cè)核酸和已知核酸序列，已知核酸序列且已標(biāo)記的DNA或RNA,稱探針。雜交有固一液相雜交和液相雜交。

核酸分子雜交的基本原理核酸分子雜交技術(shù)變性復(fù)性DNA-DNA雜交雙鏈分子

具有互補(bǔ)序列兩條單鏈核酸分子在一定條件下核酸

2.1探針（Probe)的概念:

一段帶有檢測(cè)標(biāo)記的與目的基因或目的DNA特異互補(bǔ)的已知核苷酸序列。2.1探針（Probe)的概念:此技術(shù)由Southern1975年首先設(shè)計(jì)。被檢測(cè)對(duì)象為DNA。4.1Southern印跡雜交此技術(shù)由Southern1975年首先