Lecture十一基因芯片(DNAMicroarrays)

核酸與核酸反應(yīng)核酸的組成：由很多單核苷酸組成的多聚物，核苷酸是由堿基、戊糖和磷酸構(gòu)成；DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、變性與復(fù)性：當(dāng)溫度上升，穩(wěn)定核酸雙螺旋次級(jí)鍵斷裂，空間結(jié)構(gòu)破壞，變成單鏈結(jié)構(gòu)的過程；當(dāng)溫度回復(fù)正常值時(shí)，變性核酸的互補(bǔ)鏈重新締合成為雙螺旋結(jié)構(gòu)的過程稱為復(fù)性。核酸分子雜交：應(yīng)用核酸分子的變性和復(fù)性的性質(zhì)，依據(jù)兩條核酸單鏈在肯定條件下可按堿基互補(bǔ)原則退火形成雙鏈的原理，用已知的單鏈核苷酸片段作為探針檢測(cè)樣本中是否存在與其互補(bǔ)的同源核酸序列的方法回顧回顧核酸適配體（aptamer）適配體：經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選出的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸核酸適配體與靶分子結(jié)合特點(diǎn)：通過自適應(yīng)的構(gòu)象變化和三維折疊形成特異性結(jié)合位點(diǎn)適配體篩選技術(shù)：利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫，其隨機(jī)序列長(zhǎng)度在20～100個(gè)堿基左右。將隨機(jī)寡核苷酸文庫與靶分子相互作用，保留結(jié)合的寡核苷酸配基(aptamer)，經(jīng)反復(fù)擴(kuò)增、篩選數(shù)個(gè)循環(huán)，即可使與該靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸序列得到富集。優(yōu)點(diǎn)：體外篩選、分子較小、易人工合成、親和力高、特異性強(qiáng)、靶分子范圍廣、可反復(fù)變性、復(fù)性缺點(diǎn)：DNA對(duì)核酸酶水解格外敏感回顧生物傳感器第十一章基因芯片(DNAMicroarrays)內(nèi)容提要生物芯片基本概念基因芯片的載體基因芯片的探針樣本制備雜交信號(hào)檢測(cè)結(jié)果分析討論現(xiàn)狀應(yīng)用進(jìn)展方向芯片分析的實(shí)質(zhì)是在面積不大的基片（玻璃片、硅片、尼龍膜等材料）表面上有序地點(diǎn)陣排列了一系列固定于肯定位置的可尋址的識(shí)別分子，反應(yīng)結(jié)果用同位素、熒光法、化學(xué)發(fā)光法等顯示，然后用精密的掃描儀或CCD攝像技術(shù)記錄，通過計(jì)算機(jī)分析，綜合成可讀的IC總信息。11.1基本概念Bio-CPUSamplesInformation芯片分析實(shí)際上也是傳感分析的組合，芯片點(diǎn)陣中的每一個(gè)單元微點(diǎn)都是一個(gè)傳感探頭。傳感技術(shù)進(jìn)展的精髓往往都被應(yīng)用于生物芯片的進(jìn)展。陣列檢測(cè)可以大大提高檢測(cè)的效率，削減工作量，增加可比性。11.1基本概念芯片的分類：依據(jù)用途還可以把生物芯片分為兩類：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）11.1基本概念基因芯片分類：依據(jù)探針的類型和長(zhǎng)度，基因芯片可分為兩類。其中一類是較長(zhǎng)的DNA探針（>100mer）芯片，這類芯片的探針往往是PCR的產(chǎn)物，通過點(diǎn)樣方法將探針固定在芯片上，主要用于RNA的表達(dá)分析。另一類是短的寡核苷酸探針芯片，其探針長(zhǎng)度為25mer左右，一般通過在片（原位）合成方法得到，這類芯片既可用于RNA的表達(dá)監(jiān)控，也可以用于核酸序列分析。11.1基本概念基因芯片：是通過微陣列技術(shù),將高密度DNA片段陣列通過機(jī)器或原位合成方式以肯定的挨次或排列方式使其附著在如玻璃片等固相表面，以熒光標(biāo)記的DNA探針，借助堿基互補(bǔ)雜交原理，進(jìn)行大量的基因表達(dá)及監(jiān)測(cè)等方面討論的最新革命性技術(shù)。11.1基本概念工作原理：與經(jīng)典的核酸分子雜交方法是全都的，都是應(yīng)用已知核酸序列作為探針與互補(bǔ)的靶核苷酸序列雜交，通過隨后的信號(hào)檢測(cè)進(jìn)行定性與定量分析，能夠在同一時(shí)間內(nèi)平行分析大量的基因，進(jìn)行大信息量的篩選與檢測(cè)分析。微陣列技術(shù)巨大優(yōu)勢(shì)在于它可以并行地宏量獵取生物信息，借助此技術(shù)進(jìn)展的生物芯片則供應(yīng)了以核酸雜交為基礎(chǔ)的基因水平的表達(dá)監(jiān)控，多態(tài)性討論和基因分型(genotyping)，從而使我們對(duì)基因表達(dá)調(diào)控有更深化的了解。11.1基本概念基因芯片的優(yōu)點(diǎn)高度并行性：提高實(shí)驗(yàn)進(jìn)程、利于顯示圖譜的快速對(duì)比和閱讀，在短短的幾十分鐘至數(shù)小時(shí)內(nèi)，就可以完成用傳統(tǒng)方法需要數(shù)月才能完成的幾萬乃至幾十萬次雜交分析試驗(yàn)。多樣性：可進(jìn)行樣品的多方面分析，提高精確性，削減誤差。微型化：削減試劑用量和反應(yīng)液體積，提高樣品濃度和反應(yīng)速率。自動(dòng)化：降低成本，保證質(zhì)量?；蛐酒娜秉c(diǎn)在同一溫度下雜交，不同探針雜交效率不同11.1基本概念芯片測(cè)定過程基本步驟11.1基本概念11.1基本概念載體：用于連接、吸附或包埋各種生物分子使其以水不溶性狀態(tài)行使功能的固相材料統(tǒng)稱為載體載體表面必須有可以進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)的活性基團(tuán)，以便與生物分子進(jìn)行偶聯(lián)單位載體上結(jié)合的生物分子達(dá)到最佳容量載體應(yīng)當(dāng)是惰性的和有足夠的穩(wěn)定性，包括機(jī)械的、物理的和化學(xué)穩(wěn)定性惰性：載體不干擾生物分子功能穩(wěn)定性：在壓力或酸、堿條件下而不發(fā)生變化載體具有良好的生物相容性通常要有良好的光學(xué)性質(zhì)，能適應(yīng)投射或反射光的測(cè)量11.2基因芯片的載體適用于制作生物芯片的載體材料較少，通常使用玻璃片、金屬片和有機(jī)高分子膜等來源便利，表面羥基容易活化，然后能偶聯(lián)DNA、酶、抗體、蛋白質(zhì)、多肽等大多數(shù)生物芯片采納發(fā)光檢測(cè)的方法，不管投射光還是反射光都適合11.2基因芯片的載體載體活化：通過化學(xué)反應(yīng)用各種不同的活化試劑在載體表面鍵合上活性基團(tuán)，以便與配基共價(jià)結(jié)合，形成具有不同的生物特異性的親和載體，用來固定生物活性分子。11.2基因芯片的載體探針的設(shè)計(jì)：如何選擇芯片上的探針確定芯片所要檢測(cè)的目標(biāo)對(duì)象查詢生物分子數(shù)據(jù)庫——取得相應(yīng)的DNA序列數(shù)據(jù)序列對(duì)比分析——找出特征序列，作為芯片設(shè)計(jì)的參照序列。數(shù)據(jù)庫搜尋——得到關(guān)于序列突變的信息及其它信息。cDNA芯片設(shè)計(jì)的關(guān)鍵在于數(shù)據(jù)庫的建立和數(shù)據(jù)庫信息的利用以及各種文庫的建立11.3基因芯片的探針MousecDNALibrary~22,500knowngenes&ESTs(NIA)LeukocytecDNAlibrary~6,000ESTs(ACGT,CityU)CarpFishcDNAlibrary~6,500ESTs(ACGT,CityU)HumancDNALibrary~10,000knowngenes&ESTs(Incyte,Inc)在進(jìn)行探針設(shè)計(jì)和布局時(shí)必須考慮：互補(bǔ)性、敏感性和特異性、容錯(cuò)性、牢靠性、可控性、可讀性對(duì)于DNA序列變異分析，最基本的要求是能夠檢測(cè)動(dòng)身生變異的位置，進(jìn)一步的要求是能夠發(fā)現(xiàn)發(fā)生了什么樣的變化。從雜交的單堿基錯(cuò)配辨別能力來看，當(dāng)錯(cuò)配消滅在探針中心時(shí)，辨別能力強(qiáng)，而當(dāng)錯(cuò)配消滅在探針兩端時(shí)，辨別能力格外弱。所以，在設(shè)計(jì)檢測(cè)DNA序列變異的探針時(shí)，檢測(cè)變化點(diǎn)應(yīng)該對(duì)應(yīng)于探針的中心，以得到最大的分辨率。11.3基因芯片的探針11.3基因芯片的探針原位合成直接點(diǎn)樣原位光蝕刻合成原位噴印合成

分子印章法針式點(diǎn)樣噴墨點(diǎn)樣光導(dǎo)原位合成法

基因芯片的制作方式光刻DNA合成法：由Affymetrix公司開發(fā)的，采納的技術(shù)原理是在合成堿基單體的5‘羥基末端連上一個(gè)光敏保護(hù)基。合成的第一步是利用光照耀使羥基端脫保護(hù)，然后一個(gè)5’端保護(hù)的核苷酸單體連接上去，這個(gè)過程反復(fù)進(jìn)行直至合成完畢。11.3.1光刻合成法使用多種掩蓋物能以更少的合成步驟生產(chǎn)出高密度的陣列，在合成循環(huán)中探針數(shù)目呈指數(shù)增長(zhǎng)。某一含n個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸，通過4×n個(gè)化學(xué)步驟能合成出4n個(gè)可能結(jié)構(gòu)。例如：一個(gè)完整的十核苷酸通過32個(gè)化學(xué)步驟，8個(gè)小時(shí)可能合成65,536個(gè)探針。合成的密度和精度高，能在1.6cm2的面積內(nèi)點(diǎn)40萬個(gè)cDNA目前美國(guó)Affymetrix公司已有同時(shí)檢測(cè)6,500個(gè)已知人類基因的DNA芯片，該產(chǎn)品不僅可用于基因表達(dá)分析和基因診斷等，而且在大規(guī)模藥物開發(fā)方面也具有誘人的前景光刻設(shè)備技術(shù)簡(jiǎn)潔，只能有專業(yè)化公司生產(chǎn)，需要花費(fèi)大量的時(shí)間去設(shè)計(jì)和制造價(jià)格很高的光掩模，成本高及合成效率低11.3.1光刻合成法是在經(jīng)過處理的載玻片表面鋪上一層連接分子（linker），其羥基上加有光敏保護(hù)基團(tuán)，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographicmask）保護(hù)不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羥基上的保護(hù)基團(tuán)。11.3.2光導(dǎo)原位合成法游離羥基利用化學(xué)反應(yīng)加上第一個(gè)核苷酸，所加核苷酸種類及在芯片上的部位預(yù)先設(shè)定，所引入的核苷酸帶有光敏保護(hù)基團(tuán)，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位點(diǎn)加上另外三種核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N個(gè)核苷酸長(zhǎng)的芯片需要4N個(gè)步驟。芯片原位噴印合成原理與噴墨打印類似，不過芯片噴印頭和墨盒有多個(gè)，墨盒中裝的是四種堿基等液體而不是碳粉。噴印頭可在整個(gè)芯片上移動(dòng)并依據(jù)芯片上不同位點(diǎn)探針的序列需要將特定的堿基噴印在芯片上特定位置。該技術(shù)采納的化學(xué)原理與傳統(tǒng)的DNA固相合成全都，因此不特殊制備的化學(xué)試劑。11.3.3原位噴印合成法點(diǎn)樣法是將合成好的探針、cDNA或基因組DNA通過特定的高速點(diǎn)樣機(jī)器人直接點(diǎn)在芯片上。點(diǎn)樣分子可以是核酸也可以是寡核酸。采納人工點(diǎn)樣的方法將寡核苷酸分子點(diǎn)樣于化學(xué)處理后的載玻片上，經(jīng)肯定的化學(xué)方法處理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于載玻片上，制備好的DNA芯片可置于緩沖液中保存。11.3.4點(diǎn)樣法點(diǎn)接觸法優(yōu)點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)樣機(jī)容易設(shè)計(jì)制作，是一種快速、經(jīng)濟(jì)、多功能的儀器，可以在3.6cm2的面積內(nèi)點(diǎn)10000個(gè)cDNA；具有更強(qiáng)的親和性和特異性雜交缺點(diǎn)：每個(gè)樣品必須是合成好的、經(jīng)過純化的、事先保存的11.3.4點(diǎn)樣法噴墨法：以定滴供應(yīng)的方式，通過壓電晶體或其他推動(dòng)形式從最小的噴嘴內(nèi)把生物樣品噴射到載體上可以在1cm2的面積內(nèi)點(diǎn)10000個(gè)點(diǎn)，每個(gè)樣品必須是合成好的、經(jīng)過純化的、事先保存的與點(diǎn)接觸法的差別在于噴嘴不與芯片接觸11.3.4點(diǎn)樣法用多聚賴氨酸包被固相支待物玻片，經(jīng)過分區(qū)后用計(jì)算機(jī)掌握的微陣列點(diǎn)樣機(jī)依據(jù)預(yù)先設(shè)計(jì)挨次點(diǎn)上核酸分子，點(diǎn)樣量很小，約為5nl，大規(guī)模cDNA芯片多采納這種方法。11.3.4點(diǎn)樣法末端標(biāo)記：在引物上標(biāo)記有熒光素，在DNA擴(kuò)增過程時(shí)，使新形成的DNA鏈末端帶有熒光素。隨機(jī)插入：選擇四種緘機(jī)基，使其中一種或幾種掛有熒光素，在PCR過程中，帶有熒光素的堿基和不帶熒光探針的堿基，同時(shí)參加DNA鏈的形成。11.4樣本制備制備高質(zhì)量樣本是困難的但又是極其重要的，用于基因類型分析的樣本是DNA，用于表達(dá)討論的樣本是cDNA。樣本制備后應(yīng)進(jìn)行標(biāo)記，通常為酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記和核素標(biāo)記。最常用標(biāo)記物為熒光素。是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步液相中探針與DNA片段按堿基配對(duì)規(guī)章形成雙鏈反應(yīng)。待分析基因在與芯片結(jié)合探針雜交之前必需進(jìn)行分離、擴(kuò)增及標(biāo)記。依據(jù)樣品來源、基因含量及檢測(cè)方法和分析目的不同，采納的基因分離、擴(kuò)增及標(biāo)記方法各異。高度集成的微型樣品處理系統(tǒng)如細(xì)胞分離芯片及基因擴(kuò)增芯片等是實(shí)現(xiàn)上述目的的有效手段和進(jìn)展方向。合適長(zhǎng)度的DNA有利于與探針雜交，最好在封閉循環(huán)條件下雜交，雜交爐11.5雜交是芯片技術(shù)中除方陣構(gòu)建外最重要的一步雜交條件的選擇與討論目的有關(guān)，多態(tài)性分析或者基因測(cè)序時(shí)，每個(gè)核苷酸或突變位點(diǎn)都必須檢測(cè)出來，選擇雜交條件時(shí)，必須滿意檢測(cè)時(shí)的靈敏度和特異性。使能檢測(cè)到低豐度基因，且能保證每條探針都能與互補(bǔ)模板雜交。通常設(shè)計(jì)出一套四種寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每個(gè)位點(diǎn)，只在中央位點(diǎn)堿基有所不同，依據(jù)每套探針在某一特點(diǎn)位點(diǎn)的雜交嚴(yán)謹(jǐn)程度，即可測(cè)定出該堿基的種類。如果芯片僅用于檢測(cè)基因表達(dá)，只需設(shè)計(jì)出針對(duì)基因中的特定區(qū)域的幾套寡聚核苷酸即可表達(dá)檢測(cè)需要長(zhǎng)的雜交時(shí)間，更高的嚴(yán)謹(jǐn)性，更高的樣品濃度和低溫度，這有利于增加檢測(cè)的特異性和低拷貝基因檢測(cè)的靈敏度。突變檢測(cè)，要鑒別出單堿基錯(cuò)配，需要更高的雜交嚴(yán)謹(jǐn)性和更短的時(shí)間。11.5雜交由于完全正常的Watson-Crick配對(duì)雙鏈要比具有錯(cuò)配(mismatch)堿基的雙鏈分子具有較高的熱力學(xué)穩(wěn)定性，所以，前者的熒光強(qiáng)度要比后者強(qiáng)出5-35%。該檢測(cè)方法是具有肯定特異性的，而且熒光信號(hào)的強(qiáng)度還與樣品中靶分子含量呈肯定的線性關(guān)系。由于DNA芯片本身的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，需要確定雜交信號(hào)在芯片上的位置，尤其是大規(guī)模DNA芯片由于其面積小，密度大，點(diǎn)樣量很少，所以雜交信號(hào)較弱，需要使用光電倍增管或冷卻的電荷偶連照相機(jī)(charged-coupleddevicecamera，CCD)攝像機(jī)等弱光信號(hào)探測(cè)裝置。大多數(shù)DNA芯片雜交信號(hào)譜型除了分布位點(diǎn)以外還需要確定每一點(diǎn)上的信號(hào)強(qiáng)度，以確定是完全雜交還是不完全雜交，因而探測(cè)方法的靈敏度及線性響應(yīng)也是格外重要的。雜交信號(hào)探測(cè)系統(tǒng)主要包括雜交信號(hào)產(chǎn)生、信號(hào)收集及傳輸和信號(hào)處理及成像三個(gè)部分組成。11.6信號(hào)檢測(cè)激光掃描熒光顯微鏡：將雜交后的芯片經(jīng)處理后固定在計(jì)算機(jī)掌握的二維傳動(dòng)平臺(tái)上，并將一物鏡置于其上方，由氬離子激光器產(chǎn)生激發(fā)光經(jīng)濾波后通過物鏡聚焦到芯片表面，激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，光斑半徑約為5－10μm。同時(shí)通過同一物鏡收集熒光信號(hào)經(jīng)另一濾波片濾波后，由冷卻的光電倍增管探測(cè)，經(jīng)模數(shù)轉(zhuǎn)換板轉(zhuǎn)換為數(shù)字信號(hào)。通過計(jì)算機(jī)掌握傳動(dòng)平臺(tái)X－Y方向上步進(jìn)平移，DNA芯片被逐點(diǎn)照耀，所采集熒光信號(hào)構(gòu)成雜交信號(hào)譜型，送計(jì)算機(jī)分析處理，最后形成20μm象素的圖像。分辨率高、圖像質(zhì)量較好，適用于各種主要類型的DNA芯片及大規(guī)模DNA芯片雜交信號(hào)檢測(cè)，廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)、基因診斷等方面討論；但靈敏度較低11.6信號(hào)檢測(cè)激光掃描共聚焦顯微鏡：激光掃描共聚焦顯微鏡與激光掃描熒光顯微鏡結(jié)構(gòu)格外相像，但是由于采納了共聚焦技術(shù)因而更具優(yōu)越性。這種方法可以在熒光標(biāo)記分子與DNA芯片雜交的同時(shí)進(jìn)行雜交信號(hào)的探測(cè)，而無須清洗掉未雜交分子，從而簡(jiǎn)化了操作步驟大大提高了工作效率。通過計(jì)算機(jī)掌握激光束或樣品池的移動(dòng)，便可實(shí)現(xiàn)對(duì)芯片的二維掃描，移動(dòng)步長(zhǎng)與芯片上寡核苷酸的間距匹配，在幾分鐘至幾十分鐘內(nèi)即可獲得熒光標(biāo)記雜交信號(hào)圖譜。靈敏度和分辨率較高，掃描時(shí)間長(zhǎng)，比較適合討論用。11.6信號(hào)檢測(cè)采納了CCD相機(jī)的熒光顯微鏡：這種探測(cè)裝置與以上的掃描方法都是基于熒光顯微鏡，但是以CCD相機(jī)作為信號(hào)接收器而不是光電倍增管，因而無須掃描傳動(dòng)平臺(tái)。由于采納了CCD相機(jī)，因而大大提高了獵取熒光圖像的速度，曝光時(shí)間可縮短至零點(diǎn)幾秒至十幾秒。掃描時(shí)間短，靈敏度和分辨率較低，比較適合臨床診斷用光纖傳感器將DNA芯片直接做在光纖維束的切面上（遠(yuǎn)端），光纖維束的另一端（近端）經(jīng)特制的耦合裝置耦合到熒光顯微鏡中。化學(xué)方法合成的寡核苷酸探針共價(jià)結(jié)合于每根光纖的遠(yuǎn)端組成寡核苷酸陣列。將光纖遠(yuǎn)端浸入到熒光標(biāo)記的靶分子溶液中與靶分子雜交，通過光纖維束傳導(dǎo)來自熒光顯微鏡的激光（490urn），激發(fā)熒光標(biāo)記物產(chǎn)生熒光，仍用光纖維束傳導(dǎo)熒光信號(hào)返回到熒光顯微鏡，由CCD相機(jī)接收。快速、便捷，可實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA微陣列雜交情況而且具有較高的靈敏度，但由于光纖維束所含光纖數(shù)目有限，因而不便于制備大規(guī)模DNA芯片，有肯定的應(yīng)用局限性11.6信號(hào)檢測(cè)芯片掃讀裝置依據(jù)采納的光電偶合器件，分為光電倍增管型和CCD型。依據(jù)激光光源，可分為激光型和非激光型。應(yīng)用最為廣泛的是激光光源的共聚焦掃描裝置，分辨率、靈敏度極高，有良好的定位功能，可定量，應(yīng)用廣泛。11.6信號(hào)檢測(cè)GenearrayTM掃描儀：激光：氬離子,488nm適用染料：熒光素、藻紅素單掃描時(shí)間：<4分鐘分辨率：3、6、9或24微米圖像分析：樣品與探針的錯(cuò)配是影響雜交反應(yīng)結(jié)果的重要因素，但由于樣品與芯片上的探針正確配對(duì)時(shí)產(chǎn)生的熒光信號(hào)要比錯(cuò)配時(shí)強(qiáng)的多，因此，通過對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的分析，就可以區(qū)分正確與錯(cuò)誤的配對(duì)。簡(jiǎn)潔的雜交圖譜一般需由圖象分析軟件來完成，圖象處理軟件必須具備提取基因庫和數(shù)據(jù)庫的能力。11.7結(jié)果分析分析軟件的功能：鑒定每個(gè)點(diǎn)陣、最大限度消除本底熒光的干擾、解析多種顏色圖象、可標(biāo)記或排解假陽性、識(shí)別和分析對(duì)比實(shí)驗(yàn)是否成功、可將信號(hào)標(biāo)準(zhǔn)化等。Step1-樣點(diǎn)的識(shí)別：先確定樣點(diǎn)的也許位置，再對(duì)網(wǎng)格定位Step2-背景的確定：芯片圖像中各樣點(diǎn)的信號(hào)值包括樣品的真正信號(hào)和背景值，在提取樣點(diǎn)信號(hào)前必須扣除背景。Step3-樣點(diǎn)信號(hào)的確定：將套住樣點(diǎn)圓內(nèi)個(gè)像素信號(hào)值減去背景值，常用表示方式有中值、平均值、總信號(hào)值等方式Step4-歸一化：“看家基因”法、總值歸一法、中值歸一法等看家基因是一個(gè)通用基因或DNA片段，其在幾個(gè)不同實(shí)驗(yàn)中的表達(dá)極少受其他因素的轉(zhuǎn)變而基本保持全都。看家基因作為陽性對(duì)比，將全部樣點(diǎn)的校正信號(hào)值除以看家基因點(diǎn)的校正信號(hào)值，從而達(dá)到歸一化的目的。11.7結(jié)果分析Step5-結(jié)果的顯示：歸一化后即可求雙色熒光芯片圖像的比例信息。基因表達(dá)討論中比例信息代表了兩個(gè)不用樣品表達(dá)mRNA的水平。結(jié)果常用圖形顯示，包括偽彩色比例圖、散點(diǎn)圖等。11.7結(jié)果分析偽彩色比例圖：依據(jù)生物芯片不同顏色熒光染料，用相應(yīng)的顏色來表示該熒光圖象，亮度表示樣點(diǎn)的歸一化校正信號(hào)，樣點(diǎn)的信號(hào)越強(qiáng)則顏色越亮，兩種顏色顯示重疊在一起就產(chǎn)生很多種顏色，表示該樣點(diǎn)表達(dá)的情況。對(duì)比樣品用綠色染料Cy3標(biāo)記，試驗(yàn)樣品用紅色染料Cy5標(biāo)記，比例圖像中不同亮度的兩種顏色疊加就可以產(chǎn)生綠-橙-紅的色度變化，綠色表示對(duì)比樣品mRNA完全表達(dá)而試驗(yàn)樣品mRNA未表達(dá)，紅色表示對(duì)比樣品mRNA未表達(dá)而試驗(yàn)樣品mRNA完全表達(dá)。11.7結(jié)果分析散點(diǎn)圖：橫坐標(biāo)表示對(duì)比樣品如Cy3標(biāo)記的樣品樣點(diǎn)的歸一化校正信號(hào)值或其對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)表示試驗(yàn)樣品如Cy5標(biāo)記的樣品樣點(diǎn)的歸一化校正信號(hào)值或其對(duì)數(shù)若兩個(gè)樣品的表達(dá)程度全都，則散點(diǎn)集中在通過原點(diǎn)的斜率為1的直線四周；若兩個(gè)樣品的表達(dá)程度不全都，則散點(diǎn)會(huì)偏離45度線ratio>2.0(up-regulated);ratio<0.5(down-regulated)ratio>2.0Ratio<0.5Step6-結(jié)果有效性的證實(shí)在表達(dá)矩陣上，有時(shí)難于區(qū)分極其相像的序列，如基因族成員，亞類或異類的存在。比較兩種不同DNA序列表達(dá)水平常，有些參數(shù)如核苷酸的成分、二級(jí)結(jié)構(gòu)的存在和矩陣上DNA的長(zhǎng)度都會(huì)影響雜交。證實(shí)矩陣分析的結(jié)果可用RT-PCR(區(qū)分基因族成員,比較不同DNA種系表達(dá),證實(shí)基因變異或突變和精確測(cè)定DNA表達(dá)水平)、NorthernBlot(證實(shí)某一基因的相對(duì)表達(dá)水平)、WesternBlot(RNA表達(dá)是否達(dá)到細(xì)胞中的蛋白水平)、質(zhì)譜儀(證實(shí)矩陣結(jié)果是否在蛋白水平)等。11.7結(jié)果分析數(shù)據(jù)處理：從生物芯片的圖像分析中取得了大量的數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)是難以理解的，必須用專門的軟件從中提取有用信息。常用的處理方法主要是聚類分析，包括系統(tǒng)聚類分析(hierarchicalclustering)和逐步聚類分析(K-Meansclustering)11.7結(jié)果分析系統(tǒng)聚類分析是將芯片表達(dá)的數(shù)據(jù)點(diǎn)安排進(jìn)入有嚴(yán)格等級(jí)的層層嵌套的子集，最相接近的數(shù)據(jù)點(diǎn)分成一簇，并用一個(gè)新點(diǎn)來替換，該新點(diǎn)的值為此兩點(diǎn)的平均值，其他點(diǎn)同樣處理，然后用同樣的方法進(jìn)行下級(jí)處理，直至最終成為一個(gè)點(diǎn)，這樣數(shù)據(jù)就形成一個(gè)家譜的樹狀結(jié)構(gòu)，樹枝的長(zhǎng)度表示兩簇?cái)?shù)據(jù)的相像程度。系統(tǒng)聚類分析適合于具有真正等級(jí)下傳的數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)，不適合于基因表達(dá)譜可能相像的簡(jiǎn)潔數(shù)據(jù)集11.7結(jié)果分析逐步聚類分析是按用戶輸入的k值將數(shù)據(jù)集隨機(jī)的分成k簇，然后(a)計(jì)算每簇的平均值，(b)隨機(jī)選擇一個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，將此數(shù)據(jù)點(diǎn)加入平均值與該點(diǎn)值最接近的簇，重新計(jì)算簇的平均值，重復(fù)上述2個(gè)步驟直至沒有數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)變簇時(shí)，計(jì)算結(jié)束。每次迭代過程中簇的轉(zhuǎn)變使簇內(nèi)的變異最小，簇間的變異最大，這樣使簇不斷地改進(jìn)，使得組間差異達(dá)到最大值逐步聚類分析適合于分類相像基因11.8基因芯片討論現(xiàn)狀現(xiàn)在全世界已有十多家公司專門從事基因芯片的討論和開發(fā)工作，而且已有較為成型的產(chǎn)品和設(shè)備問世。這些公司主要以美國(guó)的Affymetrix公司為代表，產(chǎn)品已有部分投放市場(chǎng)，產(chǎn)生的社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益令人矚目。用生物芯片進(jìn)行藥理遺傳學(xué)和藥理基因組學(xué)討論所涉及的世界藥物市場(chǎng)每年約1800億美元。2010年僅美國(guó)用于基因組討論的芯片銷售額達(dá)400億美元，這還不包括用于疾病預(yù)防及診斷及其他領(lǐng)域中的基因芯片。11.8基因芯片討論現(xiàn)狀11.8基因芯片討論現(xiàn)狀11.8基因芯片討論現(xiàn)狀我國(guó)生物芯片討論始于1997年，在上海和北京建立了2個(gè)生物芯片國(guó)家工程討論中心。目前，我國(guó)已有500余種生物芯片及相關(guān)產(chǎn)品問世。多個(gè)芯片產(chǎn)品獲得了不同形式的新藥及醫(yī)療器械證書，10余個(gè)芯片產(chǎn)品實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)，2005年實(shí)現(xiàn)銷售額近2.5億元，部分產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)。我國(guó)生物芯片企業(yè)不少于50家，70-80%的生物芯片還只是用于研發(fā)，離完全商業(yè)化還有一段不短的距離。由于研發(fā)成本高，產(chǎn)品價(jià)格也較高。11.8基因芯片討論現(xiàn)狀11.9基因芯片應(yīng)用基因功能分析討論檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因,進(jìn)而用于疾病診斷藥物篩選

檢測(cè)基因突變其他(環(huán)境化學(xué)毒物的篩選\體質(zhì)醫(yī)學(xué)的討論)11.9基因芯片應(yīng)用基因功能分析討論將成千上萬個(gè)我們克隆到的特異性靶基因固定在一塊芯片上，對(duì)來源于不同個(gè)體不同組織不同細(xì)胞周期不同發(fā)育階段不同分化階段不同病變不同刺激（包括不同誘導(dǎo)不同治療手段）下細(xì)胞內(nèi)的mRNA或逆轉(zhuǎn)錄所得的cDNA進(jìn)行檢測(cè)，從而對(duì)這些基因表達(dá)的個(gè)體特異性組織特異性發(fā)育階段特異性分化階段特異性。進(jìn)行綜合評(píng)定與推斷，極大加快這些基因功能的確立。檢測(cè)與疾病相關(guān)的基因，進(jìn)而用于疾病診斷。目前主要涉及：癌癥心血管疾病血液病遺傳性疾病神經(jīng)系統(tǒng)疾病部分感染性疾病免疫反應(yīng)相關(guān)性疾病毒物引起的損傷等11.9基因芯片應(yīng)用11.9基因芯