第十二章熒光分析法課件

熒光分析的基本原理熒光定量分析方法熒光分析儀器與技術(shù)熒光分析法熒光分析的基本原理熒光分析法熒光分析法概述光致發(fā)光：吸收某種波長(zhǎng)的光后發(fā)射出比吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光的現(xiàn)象。熒光分析法

(fluorormetry)熒光光譜→定性分析熒光強(qiáng)度→定量分析熒光分析的分類分析對(duì)象激發(fā)光波長(zhǎng)范圍(熒光和磷光)原子熒光分析分子熒光分析

紫外-可見(jiàn)熒光分析紅外熒光分析X射線熒光分析熒光分析法概述光致發(fā)光：吸收某種波長(zhǎng)的光后發(fā)射出比吸收波長(zhǎng)更熒光分析法與紫外-可見(jiàn)分光光度法的主要區(qū)別紫外光I0IA∝CF(S=10-9~10-12g/ml)樣品溶液UV-vis(S=10-6~10-7g/ml)F∝C熒光分析法熒光分析法概述（續(xù)前）平行于入射光垂直于入射光優(yōu)點(diǎn)：靈敏度高（吸收）（發(fā)射）熒光分析法與紫外-可見(jiàn)分光光度法的主要區(qū)別紫外光I0IA∝C熒光分析法的基本原理分子熒光的產(chǎn)生原理熒光物質(zhì)分子的光譜特征熒光強(qiáng)度及其影響因素?zé)晒夥治龇ǖ幕驹矸肿訜晒獾漠a(chǎn)生原理單重態(tài)與三重態(tài)單重態(tài)(sigletstate,S)：總自旋量子數(shù)s=1/2+(-1/2)=0;多重性M=2s+1=1基態(tài)(S0)三重態(tài)(tripletstate,T)：

s=1/2+1/2=1；M=2s+1=3激發(fā)單重態(tài)(S)激發(fā)三重態(tài)(T)單重態(tài)與三重態(tài)單重態(tài)(sigletstate,S)：基態(tài)(激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑

振動(dòng)弛豫(vibrationalrelexation)內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換(internalconversion)熒光(fluorescence)發(fā)射外部能量轉(zhuǎn)換(externalconversion)體系間跨越(intersystemcrossing)磷光發(fā)射激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑振動(dòng)弛豫(vibrational激發(fā)態(tài)→基態(tài)途徑（圖）吸收基態(tài)(S0)第二電子激發(fā)單重態(tài)(S2*)第一電子激發(fā)三重態(tài)(T1*)振動(dòng)弛豫內(nèi)轉(zhuǎn)換熒光外轉(zhuǎn)換體系間跨越磷光第一電子激發(fā)單重態(tài)(S1*)S1*(V=0)激發(fā)態(tài)→基態(tài)途徑（圖）吸收基態(tài)(S0)第二電子激發(fā)單重態(tài)(S振動(dòng)弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非輻射~10-12s內(nèi)部能量轉(zhuǎn)換（內(nèi)轉(zhuǎn)換）激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑（續(xù)前）S1*(V=n)S2*(V=0)非輻射E很小熒光發(fā)射

S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫輻射熒光：物質(zhì)分子接受光能激發(fā)后，從第一電子激發(fā)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)返回基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。振動(dòng)弛豫S1*(V=n)S1*(V=0)非輻射~10-12s外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞轉(zhuǎn)移能量熱平衡過(guò)程S1*(V=0)T1*(V=n)非輻射激發(fā)態(tài)分子返回基態(tài)的途徑（續(xù)前）磷光發(fā)射

體系間跨越體系間跨越

S1*(V=0)振動(dòng)馳豫Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換S0(V=n)輻射T1*(V=0)（10-4~10s）T1*(V=n)振動(dòng)弛豫T1*(V=n)S1*(V=0)非輻射外部能量轉(zhuǎn)換（外轉(zhuǎn)換）S1*(V=0)S0(V=n)碰撞轉(zhuǎn)移熒光和磷光的主要區(qū)別發(fā)光機(jī)制實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象熒光磷光單重態(tài)→單重態(tài)激發(fā)光停止照射→熒光立即消失三重態(tài)→單重態(tài)激發(fā)光停止照射→磷光仍將延續(xù)一段時(shí)間熒光和磷光的主要區(qū)別發(fā)光機(jī)制實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象熒光磷光單重態(tài)→單重態(tài)激激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)——熒光物質(zhì)分子的兩個(gè)特征光譜激發(fā)光譜(excitationspectrum)：

F~

ex

熒光光譜(fluorescencespectrum)：

F~

em激發(fā)光譜與發(fā)射（熒光）光譜激發(fā)波長(zhǎng)發(fā)射波長(zhǎng)——熒光物質(zhì)分子的硫酸奎寧的激發(fā)光譜及熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜硫酸奎寧的激發(fā)光譜及熒光光譜激發(fā)光譜熒光光譜熒光光譜的特征斯托克斯位移(Stokesshift)

熒光發(fā)射波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)（能量損失）熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

激發(fā)：S0(V=0)→Sn*(V=n)熒光：S1*(V=0)→S0(V=n)S1*(V=0)S0(V=n)Sn*(V=n)內(nèi)轉(zhuǎn)換振動(dòng)馳豫輻射

熒光光譜的特征斯托克斯位移(Stokesshift)熒光熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜（實(shí)線）熒光光譜

S0→S2*激發(fā)光譜S0→S1*激發(fā)光譜熒光光譜與激發(fā)光譜呈鏡像關(guān)系蒽的激發(fā)光譜（虛線）和熒光光譜激發(fā)光譜：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)熒光光譜：S1*(V=0)→S0(V=1,2,3,4)

蒽的能級(jí)躍遷熒光光譜的特征（續(xù)前）激發(fā)光譜：S0(V=0)→S1*(V=1,2,3,4)蒽的能熒光壽命和熒光效率

熒光壽命(fluorescencelifttime,

f)：當(dāng)激發(fā)光停止照射時(shí)，分子的熒光強(qiáng)度降低到激發(fā)時(shí)最大熒光強(qiáng)度的1/e所需的時(shí)間?！獰晒馕镔|(zhì)的兩個(gè)重要發(fā)光參數(shù)指數(shù)衰減定律：Ft=F0e-Kt

(K：衰減常數(shù))

t=

f→Ft=(1/e)F0

Ft/F0-t作圖→直線斜率=1/

f→

f

=1/斜率熒光壽命和熒光效率熒光壽命(fluorescenceli熒光效率(fluorescenceefficiency)

熒光量子產(chǎn)率(fluorescencequantumyield)物質(zhì)

f溶劑熒光素鈉0.92水熒光素0.65水蒽0.30乙醇菲1.00乙醇熒光效率(fluorescenceefficiency)

物質(zhì)分子能發(fā)射熒光的兩個(gè)必要條件有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收有一定的熒光效率n→

*

→

*共軛雙鍵，K帶強(qiáng)吸收，熒光效率高，熒光強(qiáng)度強(qiáng)。弱吸收，體系間跨越幾率大，熒光較弱，意義不大。物質(zhì)分子能發(fā)射熒光的兩個(gè)必要條件有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收n→有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)）共軛系統(tǒng)↑→

f↑→

ex、

em↑有機(jī)化合物分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)（芳香環(huán)、稠環(huán)或雜環(huán)

ex=327nm，

em=510nm稠芳環(huán)分子的幾何排列對(duì)熒光的影響含有長(zhǎng)共軛雙鍵的脂肪烴

ex=327nm，em=510nm稠芳環(huán)分子的幾何排分子的剛性和共平面性共軛系統(tǒng)的剛性和共平面性↑→

f↑聯(lián)苯

f=0.2芴

f=1.0分子的剛性和共平面性共軛系統(tǒng)的剛性和共平面性↑→f↑金屬離子絡(luò)合增加分子剛性和共平面性8-羥基喹啉8-羥基喹啉鎂位阻效應(yīng)和立體效應(yīng)→

f↓1-二甲氨基萘-7-磺酸鹽1-二甲氨基萘-8-磺酸鹽

f=0.75

f=0.03位阻效應(yīng)金屬離子絡(luò)合增加分子剛性和共平面性取代基供電子基：

–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-CN

→

f

↑，F(xiàn)↑吸電子基：

-NO2、-COOH、-NHCOCH3、-C=O、-NO、-SH、-X→

f

↓，F(xiàn)↓，甚至熒光熄滅-R、-SO3H、-NH3+→對(duì)

f

無(wú)影響

取代基供電子基：–NH2、-OH、-NHR、-NR2、-C影響熒光強(qiáng)度的外界因素溫度T↓→F↑溶劑極性↑→

f↑→F↑→↑粘度↓→分子間碰撞幾率↑→F↓含重原子(CBr4、CH3CH2I)→F↓形成氫鍵→S1*(V=0)分子↓→F↓pH值pH<2pH7~12pH>13弱酸、弱堿蘭色熒光影響熒光強(qiáng)度的外界因素溫度T↓→F↑溶劑極性↑→f↑→F↑熒光熄滅劑熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子碰撞而引起熒光強(qiáng)度降低或熒光強(qiáng)度與濃度不呈線性關(guān)系的現(xiàn)象。熒光熄滅劑(quenchingmedium)：引起熒光熄滅的物質(zhì)。如鹵素離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物、羰基、羧基化合物均為常見(jiàn)的熒光熄滅劑。熒光熄滅劑熒光熄滅（熒光猝滅）：由于熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或引起熒光熄滅的原因碰撞→損失能量作用→不發(fā)光物質(zhì)重原子Br/I→體系間跨越→三重態(tài)溶解O2→熒光物質(zhì)氧化/O2順磁性→體系間跨越→三重態(tài)熒光自熄滅：熒光物質(zhì)濃度超過(guò)1g/L時(shí)，增加熒光分子間碰撞幾率而產(chǎn)生的熒光熄滅現(xiàn)象。(濃度限量1

g~1mg/ml)熒光熄滅法(fluorescencequenchingmethod)：利用熒光物質(zhì)熒光強(qiáng)度的減弱與熒光熄滅劑的濃度呈線性關(guān)系測(cè)定熒光熄滅劑含量的方法。引起熒光熄滅的原因碰撞→損失能量熒光熄滅法(fluoresc種類瑞利光(Reyleighscatteringlight)：彈性碰撞，不發(fā)生能量交換，僅改變光子運(yùn)動(dòng)方向，波長(zhǎng)及頻率不變。拉曼光(Ramanscatteringlight)：非彈性碰撞，發(fā)生能量交換，光子的運(yùn)動(dòng)方向和波長(zhǎng)、頻率均發(fā)生改變。較長(zhǎng)拉曼光干擾熒光測(cè)定。散射光散射光(scatteringlight)：由于光子與物質(zhì)分子相互碰撞，使光子的運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變而向不同角度散射。種類較長(zhǎng)拉曼光干擾熒光測(cè)定。散射光散射光(scatterin硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜拉曼光譜瑞利光320nm拉曼光360nm拉曼光400nm熒光448nm激發(fā)320nm激發(fā)350nm瑞利光350nm硫酸奎寧在不同激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光(a)與拉曼光譜(b)熒光光譜熒光定量分析熒光定量分析的依據(jù)——F與C的關(guān)系熒光定量分析方法熒光分析法與UV-vis定量分析的區(qū)別熒光定量分析熒光定量分析的依據(jù)——F與C的關(guān)系熒光強(qiáng)度F與濃度C的關(guān)系溶液的熒光測(cè)定激發(fā)光源垂直方向熒光測(cè)定方向：激發(fā)光源垂直方向，避免透射光干擾。F=K

(I0–I)

(I=I010-ECl)

=K

(I0-I010-ECl)=K

I0(1-10-ECl)=K

I0(1-e-2.3ECl)太勞極數(shù)展開(kāi)式：ex=1+x/1！+x2/2！+x3/3！+……

熒光強(qiáng)度F與濃度C的關(guān)系溶液的熒光測(cè)定激發(fā)光源垂直方向熒光測(cè)ECl≤0.05F=2.3K

I0ECl=KC熒光分析法僅適用于稀溶液的測(cè)定滿足定量分析條件：ECl≤0.05→F∝C降低熒光自熄滅（內(nèi)部猝滅）作用靈敏度高（放大信號(hào)）F與C的關(guān)系推導(dǎo)（續(xù)前）熒光定量分析的依據(jù)

ECl≤0.05F=2.3KI0ECl=KC熒光分析法僅熒光分析法與UV-vis靈敏度差異紫外-可見(jiàn)分光光度法定量依據(jù)：A∝C

檢測(cè)信號(hào)：A=-lg(I/I0)=ECl

C↓→I0/I≈1→A≈0

熒光分析法定量依據(jù)：F∝I0及C

檢測(cè)信號(hào)：F=2.3K

I0ECl

C↓→F↓→放大信號(hào)（檢測(cè)靈敏度↑）→I0↑→F↑→熒光分析靈敏度高→放大信號(hào)→I0↑，I↑→I/I0不變→UV-vis靈敏度受限，不如熒光分析(S=10-6~10-7g/ml)(S=10-9~10-12g/ml)

熒光分析法與UV-vis靈敏度差異紫外-可見(jiàn)分光光度法定量依熒光定量分析方法校正曲線法(F~C)

熒光分析法與UV-vis定量測(cè)定時(shí)儀器校正的區(qū)別0100%UV-vis熒光分析法T=0，A=∞關(guān)閉光閘，光不透過(guò)，全吸收T=100%，A=0空白溶液，光全透過(guò)，不吸收F=0空白溶液，不發(fā)射熒光F=100%對(duì)照品溶液CmaxF=50%(Cmid)熒光定量分析方法校正曲線法(F~C)熒光分析法與UV-vi比例法熒光定量分析方法（續(xù)前）適用：校正曲線過(guò)原點(diǎn)多組分混合物測(cè)定

原理：熒光強(qiáng)度的加和性方法：解聯(lián)立方程空白調(diào)零降低測(cè)定的靈敏度：儀器調(diào)零→F0→Fs和Fx→扣除空白(Fs-F0、Fx-F0)計(jì)算。比例法熒光定量分析方法（續(xù)前）適用：校正曲線過(guò)原點(diǎn)多組分混合熒光分析儀器與技術(shù)熒光分析儀器類型、主要部件和校正熒光分析新技術(shù)熒光分析的應(yīng)用熒光分析儀器與技術(shù)熒光分析儀器類型、主要部件和校正熒光分析儀器類型濾光片熒光計(jì)分光系統(tǒng)：激發(fā)濾光片（帶通型）發(fā)射濾光片（截止型）用途：可用于定量分析；不能測(cè)定光譜濾光片-單色器熒光計(jì)分光系統(tǒng)：激發(fā)濾光片+發(fā)射光柵用途：可用于測(cè)定熒光光譜及定量分析；不能測(cè)定激發(fā)光譜，

熒光分析儀器類型濾光片熒光計(jì)濾光片-單色器熒光計(jì)930型熒光計(jì)光路示意圖激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片熒光分析儀器類型（續(xù)前）

930型熒光計(jì)光路示意圖激發(fā)濾光片發(fā)射濾光片熒光分析儀器類型熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖分光系統(tǒng)：光柵用途：測(cè)定激發(fā)光譜、熒光光譜及定量分析。最大激發(fā)波長(zhǎng)

exmax和最大熒光波長(zhǎng)

emmax是鑒定物質(zhì)的依據(jù)和定量測(cè)定時(shí)最靈敏的條件。激發(fā)單色器發(fā)射單色器熒光分析儀器類型（續(xù)前）熒光分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖分光系統(tǒng)：光柵最大激發(fā)熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：汞燈、氙燈、氘燈、溴鎢燈分光系統(tǒng)：濾光片；單色器（光柵）樣器池：低熒光材料或石英材料，四面透光檢測(cè)器：紫外-可見(jiàn)（光電倍增管）熒光分析儀器的主要部件激發(fā)光源：汞燈、氙燈、氘燈、溴鎢燈熒光分析儀器的校正靈敏度校正：對(duì)照品溶液Cmax→F=100%

Cmid→F=50%

硫酸喹啉:0.001g喹啉標(biāo)準(zhǔn)品→硫酸(0.05mol/L)→C=1

g/ml波長(zhǎng)校正：汞燈標(biāo)準(zhǔn)譜線激發(fā)光譜與熒光光譜的校正單光束：調(diào)整光源強(qiáng)度一致雙光束：參比光束抵消光學(xué)誤差熒光分析儀器的校正靈敏度校正：對(duì)照品溶液Cmax→F=10熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別

紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)熒光分光光度計(jì)光路光源儀器校正吸收池入射光與吸收光同方向入射光與熒光垂直方向兩種光源(紫外+可見(jiàn))一種光源(紫外)空白溶液(F=0)熒光對(duì)照品溶液(F=100%或50%)空白溶液(T=100%)紫外無(wú)吸收兩面透光低熒光材料四面透光熒光分光光度計(jì)與紫外分光光度計(jì)的區(qū)別紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)熒熒光分析新技術(shù)激光熒光分析時(shí)間分辨熒光分析(time-resolvedfluorometry)原理：激發(fā)和檢測(cè)之間延緩一段時(shí)間，具有不同熒光壽命的物質(zhì)分別檢測(cè)激發(fā)光源：脈沖激光優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)時(shí)排除干擾，無(wú)需化學(xué)預(yù)處理激發(fā)光源：波長(zhǎng)更短、強(qiáng)度更大的激光優(yōu)點(diǎn)：提高靈敏度(樣品量<1

l或10-16~10-14g)和專一性用途：生化樣品、氣體樣品及有機(jī)化合物的自由基熒光分析新技術(shù)激光熒光分析時(shí)間分辨熒光分析(time-res同步熒光分析原理：

=

exmax-

emmax→同步熒光光譜→

同步信號(hào)Fsp(

ex,

em)=KCFexFem用途：多核芳香族化合物熒光分析新技術(shù)（續(xù)前）膠束增敏熒光分析原理：膠束溶液的增溶、增穩(wěn)、增敏作用優(yōu)點(diǎn)：提高熒光物質(zhì)溶解度、穩(wěn)定性及靈敏度膠束溶液：一定濃度(>臨界膠束濃度CMC)的表面活性劑溶液親水基疏水基同步熒光分析原理：=exmax-emmax→同步熒光熒光分析的應(yīng)用有機(jī)化合物的熒光分析研究對(duì)象：芳香族及具有芳香結(jié)構(gòu)的化合物有機(jī)化合物：多環(huán)胺類、萘酚類、嘌啉類、吲哚類、多環(huán)芳烴類、具有芳環(huán)或芳雜環(huán)結(jié)構(gòu)的氨基酸類及蛋白質(zhì)藥物：生物堿類(麥角堿、蛇根堿、麻黃堿、嗎啡、喹啉類及異喹啉類生物堿)；甾體類(皮質(zhì)激素及雌醇)；抗生素類(青霉素、四環(huán)素)；維生素類(維生素A、B1、B2、B6、B12、E、抗壞血酸、葉酸及煙酰胺)中草藥：有效成分（芳香性結(jié)構(gòu)的大分子雜環(huán)類）熒光分析的應(yīng)用有機(jī)化合物的熒光分析研究對(duì)象：芳香族及具有芳香熒光試劑熒光胺熒光條件：

ex=275