中國藥典2021年版《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》

中國藥典2021年版《細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法》――凝膠法凝膠法凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)的原理來檢測(cè)或半定量內(nèi)毒素的方法。在本檢驗(yàn)方法規(guī)定的條件下，使鱟試劑凝集的內(nèi)毒素最低濃度為鱟試劑的標(biāo)記靈敏度，以EU/ml表示。當(dāng)使用新一批鱟試劑或試驗(yàn)條件發(fā)生任何可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，應(yīng)進(jìn)行鱟試劑的靈敏度審查試驗(yàn)。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標(biāo)示值（入），將細(xì)菌內(nèi)毒素國家標(biāo)準(zhǔn)品或細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2入、入、0.5入和0.25入四個(gè)濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每稀釋一步均應(yīng)在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10imnX75mm試管或復(fù)溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，每一個(gè)內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對(duì)照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管輕輕地從恒溫器中取出，并緩慢地翻轉(zhuǎn)180度。如果凝膠是在管中形成的，則凝膠不會(huì)變形，也不會(huì)從管壁上滑落。形成或形成的凝膠不牢固，變形，并從壁上滑落。在保溫和取試管的過程中，應(yīng)避免因振動(dòng)引起的假陰性結(jié)果。當(dāng)最大濃度2入管均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對(duì)照管為陰性，試驗(yàn)方為有效。按下式計(jì)算反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測(cè)定值（入c）」入c=1gT（￡x/4）□式中x為反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。反應(yīng)終點(diǎn)濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個(gè)呈陽性結(jié)果的濃度。當(dāng)入C在0.5入-2入（包括0.5入和2入）時(shí)，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并標(biāo)記靈敏度入為該批鱟試劑的靈敏度?！醺蓴_試驗(yàn)按表1制備溶液a、b、c和d,使用的供試品溶液應(yīng)為未檢驗(yàn)出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（mvd）的溶液，按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)項(xiàng)下操作。□只有當(dāng)溶液a和陰性對(duì)照溶液D的所有平行管均為陰性，且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度的復(fù)查范圍內(nèi)時(shí)，本試驗(yàn)才有效。根據(jù)以下公式計(jì)算系列溶液C和B的終點(diǎn)濃度的幾何平均值（es和ET）。:es=1g—1（Exs/4）et=1g—1（Ext/4）Q其中XS和XT分別是系列溶液C和溶液B的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的對(duì)數(shù)值（1g）。當(dāng)es為0.5入——兩個(gè)入（包括0.5入和2入），et為0.5es-2es（包括0.5es和2es）時(shí)，認(rèn)為供試品在此濃度下沒有干擾效應(yīng)。如果試驗(yàn)溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下干擾試驗(yàn)，則應(yīng)進(jìn)一步稀釋試驗(yàn)溶液，使其不超過MVD，然后重復(fù)干擾試驗(yàn)?！醣?凝膠法干擾試驗(yàn)溶液的制備內(nèi)毒素濃度/內(nèi)毒素溶液配制號(hào)/供試品溶液稀釋系數(shù)濃度-1248c2入/檢驗(yàn)水1248-2入入244444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444零點(diǎn)二五入二入一入零點(diǎn)五入零點(diǎn)二五入D無/檢驗(yàn)水-2注：A為試驗(yàn)溶液；B為干擾測(cè)試系列；C是鱟試劑標(biāo)記靈敏度的對(duì)照系列；D為陰性對(duì)照?？赏ㄟ^對(duì)供試品進(jìn)行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會(huì)使內(nèi)毒素失去活性，要使用預(yù)先添加了標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進(jìn)行干擾試驗(yàn)。新藥進(jìn)行內(nèi)毒素檢查前，或?qū)]有內(nèi)毒素檢查項(xiàng)目的品種建立內(nèi)毒素檢查方法時(shí)，必須進(jìn)行干擾試驗(yàn)。當(dāng)鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗(yàn)環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗(yàn)結(jié)果的變化時(shí)，須重新進(jìn)行干擾試驗(yàn)。檢驗(yàn)方法（1）凝膠限量試驗(yàn)根據(jù)表2制備溶液a、B、C和d。使用稀釋倍數(shù)為MVD的供試品溶液制備溶液A和B,干擾已消除。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作。表2凝膠限量試驗(yàn)溶液的制備編號(hào)：ABCD內(nèi)毒素濃度/制備內(nèi)毒素的溶液/無供試品溶液2入/供試品溶液2入/無供檢查的水/2222供檢查的水平管注：A為供試品溶液；為B供試品陽性對(duì)照；C為陽性對(duì)照;D為陰性對(duì)照?！踅Y(jié)果判斷保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對(duì)照溶液d的平行管均為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液b的平行管均為陽性，陽性對(duì)照溶液c的平行管均為陽性，試驗(yàn)有效。□如果溶液a的兩個(gè)平行管均為陰性，則判斷供試品符合要求；如果溶液a的兩個(gè)平行管均呈陽性，則判斷供試品不符合要求。如果溶液a的兩個(gè)平行管中的一個(gè)為陽性，另一個(gè)為陰性，則需要重新測(cè)試。復(fù)測(cè)時(shí)，溶液A應(yīng)制作四個(gè)平行管，如果所有平行管均為陰性，則應(yīng)判定供試品符合要求；否則，判定供試品不符合要求。（2）凝膠半定量試驗(yàn)該方法通過測(cè)定反應(yīng)終點(diǎn)濃度來量化試樣中的內(nèi)毒素含量。根據(jù)表3制備溶液a、B、C和d。按鱟試劑靈敏度復(fù)核試驗(yàn)操作?！醣?凝膠半定量試驗(yàn)溶液的制備No.a內(nèi)毒素濃度/制備內(nèi)毒素的無溶液/供試品溶液1248bc2入/供試品溶液2入/檢驗(yàn)水11248dNo/檢驗(yàn)水-內(nèi)毒素濃度-2入2入1入平行管的數(shù)量為2222,檢查用水為0.5入零點(diǎn)二五入一注：A為不超過MVD且通過干擾試驗(yàn)的試液。從通過干擾試驗(yàn)的稀釋倍數(shù)開始，用檢查水稀釋至1、2、4和8倍，最終稀釋不得超過MVD?！鮞為2入濃度標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素的溶液a（供試品陽性對(duì)照）。c為鱟試劑標(biāo)示靈敏度的對(duì)照系列。d為陰性對(duì)照?！踅Y(jié)果如果陰性對(duì)照溶液D的平行管為陰性，供試品陽性對(duì)照溶液B的平行管為陽性，且系列溶液C的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值為0.5入一2入，則試驗(yàn)有效?！跸盗腥芤篴中每一系列平行管的終點(diǎn)稀釋倍數(shù)乘以入，為每個(gè)系列的反應(yīng)終點(diǎn)濃度，所有平行管反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式ce=1g-1（￡x/2）〕。如果檢驗(yàn)時(shí)采用的是供試品的稀釋液，則計(jì)算原始溶液內(nèi)毒素濃度時(shí)要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如果試驗(yàn)中試驗(yàn)溶液的所有平行管均為陰性，則應(yīng)記錄內(nèi)