中國藥典2021年版《細菌內(nèi)毒素檢查法》

中國藥典2021年版《細菌內(nèi)毒素檢查法》――凝膠法凝膠法凝膠法系通過鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應的原理來檢測或半定量內(nèi)毒素的方法。在本檢驗方法規(guī)定的條件下，使鱟試劑凝集的內(nèi)毒素最低濃度為鱟試劑的標記靈敏度，以EU/ml表示。當使用新一批鱟試劑或試驗條件發(fā)生任何可能影響試驗結(jié)果的變化時，應進行鱟試劑的靈敏度審查試驗。根據(jù)鱟試劑靈敏度的標示值（入），將細菌內(nèi)毒素國家標準品或細菌內(nèi)毒素工作標準品用細菌內(nèi)毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2入、入、0.5入和0.25入四個濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10imnX75mm試管或復溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內(nèi)毒素標準溶液，每一個內(nèi)毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內(nèi)毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管輕輕地從恒溫器中取出，并緩慢地翻轉(zhuǎn)180度。如果凝膠是在管中形成的，則凝膠不會變形，也不會從管壁上滑落。形成或形成的凝膠不牢固，變形，并從壁上滑落。在保溫和取試管的過程中，應避免因振動引起的假陰性結(jié)果。當最大濃度2入管均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（入c）」入c=1gT（￡x/4）□式中x為反應終點濃度的對數(shù)值（1g）。反應終點濃度是指系列遞減的內(nèi)毒素濃度中最后一個呈陽性結(jié)果的濃度。當入C在0.5入-2入（包括0.5入和2入）時，可用于細菌內(nèi)毒素檢查，并標記靈敏度入為該批鱟試劑的靈敏度?！醺蓴_試驗按表1制備溶液a、b、c和d,使用的供試品溶液應為未檢驗出內(nèi)毒素且不超過最大有效稀釋倍數(shù)（mvd）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作?！踔挥挟斎芤篴和陰性對照溶液D的所有平行管均為陰性，且系列溶液C的結(jié)果在鱟試劑靈敏度的復查范圍內(nèi)時，本試驗才有效。根據(jù)以下公式計算系列溶液C和B的終點濃度的幾何平均值（es和ET）。:es=1g—1（Exs/4）et=1g—1（Ext/4）Q其中XS和XT分別是系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數(shù)值（1g）。當es為0.5入——兩個入（包括0.5入和2入），et為0.5es-2es（包括0.5es和2es）時，認為供試品在此濃度下沒有干擾效應。如果試驗溶液在小于MVD的稀釋倍數(shù)下干擾試驗，則應進一步稀釋試驗溶液，使其不超過MVD，然后重復干擾試驗?！醣?凝膠法干擾試驗溶液的制備內(nèi)毒素濃度/內(nèi)毒素溶液配制號/供試品溶液稀釋系數(shù)濃度-1248c2入/檢驗水1248-2入入244444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444零點二五入二入一入零點五入零點二五入D無/檢驗水-2注：A為試驗溶液；B為干擾測試系列；C是鱟試劑標記靈敏度的對照系列；D為陰性對照。可通過對供試品進行更大倍數(shù)的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內(nèi)毒素失去活性，要使用預先添加了標準內(nèi)毒素再經(jīng)過處理的供試品溶液進行干擾試驗。新藥進行內(nèi)毒素檢查前，或?qū)]有內(nèi)毒素檢查項目的品種建立內(nèi)毒素檢查方法時，必須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的配方、生產(chǎn)工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結(jié)果的變化時，須重新進行干擾試驗。檢驗方法（1）凝膠限量試驗根據(jù)表2制備溶液a、B、C和d。使用稀釋倍數(shù)為MVD的供試品溶液制備溶液A和B,干擾已消除。按鱟試劑靈敏度復核試驗操作。表2凝膠限量試驗溶液的制備編號：ABCD內(nèi)毒素濃度/制備內(nèi)毒素的溶液/無供試品溶液2入/供試品溶液2入/無供檢查的水/2222供檢查的水平管注：A為供試品溶液；為B供試品陽性對照；C為陽性對照;D為陰性對照?！踅Y(jié)果判斷保溫60分鐘±2分鐘后觀察結(jié)果。若陰性對照溶液d的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液b的平行管均為陽性，陽性對照溶液c的平行管均為陽性，試驗有效?！跞绻芤篴的兩個平行管均為陰性，則判斷供試品符合要求；如果溶液a的兩個平行管均呈陽性，則判斷供試品不符合要求。如果溶液a的兩個平行管中的一個為陽性，另一個為陰性，則需要重新測試。復測時，溶液A應制作四個平行管，如果所有平行管均為陰性，則應判定供試品符合要求；否則，判定供試品不符合要求。（2）凝膠半定量試驗該方法通過測定反應終點濃度來量化試樣中的內(nèi)毒素含量。根據(jù)表3制備溶液a、B、C和d。按鱟試劑靈敏度復核試驗操作?！醣?凝膠半定量試驗溶液的制備No.a內(nèi)毒素濃度/制備內(nèi)毒素的無溶液/供試品溶液1248bc2入/供試品溶液2入/檢驗水11248dNo/檢驗水-內(nèi)毒素濃度-2入2入1入平行管的數(shù)量為2222,檢查用水為0.5入零點二五入一注：A為不超過MVD且通過干擾試驗的試液。從通過干擾試驗的稀釋倍數(shù)開始，用檢查水稀釋至1、2、4和8倍，最終稀釋不得超過MVD?！鮞為2入濃度標準內(nèi)毒素的溶液a（供試品陽性對照）。c為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。d為陰性對照?！踅Y(jié)果如果陰性對照溶液D的平行管為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管為陽性，且系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值為0.5入一2入，則試驗有效?！跸盗腥芤篴中每一系列平行管的終點稀釋倍數(shù)乘以入，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內(nèi)毒素濃度（按公式ce=1g-1（￡x/2）〕。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內(nèi)毒素濃度時要將結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。如果試驗中試驗溶液的所有平行管均為陰性，則應記錄內(nèi)