中國藥典2021年版《細菌內毒素檢查法》

中國藥典2021年版《細菌內毒素檢查法》――凝膠法凝膠法凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測或半定量內毒素的方法。在本檢驗方法規(guī)定的條件下，使鱟試劑凝集的內毒素最低濃度為鱟試劑的標記靈敏度，以EU/ml表示。當使用新一批鱟試劑或試驗條件發(fā)生任何可能影響試驗結果的變化時，應進行鱟試劑的靈敏度審查試驗。根據鱟試劑靈敏度的標示值（入），將細菌內毒素國家標準品或細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水溶解，在旋渦混合器上混勻15分鐘，然后制成2入、入、0.5入和0.25入四個濃度的內毒素標準溶液，每稀釋一步均應在旋渦混合器上混勻30秒鐘。取分裝有0.1ml鱟試劑溶液的10imnX75mm試管或復溶后的0.1ml/支規(guī)格的鱟試劑原安瓿18支，其中16管分別加入0.1ml不同濃度的內毒素標準溶液，每一個內毒素濃度平行做4管；另外2管加入0.1ml細菌內毒素檢查用水作為陰性對照。將試管中溶液輕輕混勻后，封閉管口，垂直放入37℃±1℃恒溫器中，保溫60分鐘±2分鐘。將試管輕輕地從恒溫器中取出，并緩慢地翻轉180度。如果凝膠是在管中形成的，則凝膠不會變形，也不會從管壁上滑落。形成或形成的凝膠不牢固，變形，并從壁上滑落。在保溫和取試管的過程中，應避免因振動引起的假陰性結果。當最大濃度2入管均為陽性，最低濃度0.25入管均為陰性，陰性對照管為陰性，試驗方為有效。按下式計算反應終點濃度的幾何平均值，即為鱟試劑靈敏度的測定值（入c）」入c=1gT（￡x/4）□式中x為反應終點濃度的對數值（1g）。反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中最后一個呈陽性結果的濃度。當入C在0.5入-2入（包括0.5入和2入）時，可用于細菌內毒素檢查，并標記靈敏度入為該批鱟試劑的靈敏度?！醺蓴_試驗按表1制備溶液a、b、c和d,使用的供試品溶液應為未檢驗出內毒素且不超過最大有效稀釋倍數（mvd）的溶液，按鱟試劑靈敏度復核試驗項下操作。□只有當溶液a和陰性對照溶液D的所有平行管均為陰性，且系列溶液C的結果在鱟試劑靈敏度的復查范圍內時，本試驗才有效。根據以下公式計算系列溶液C和B的終點濃度的幾何平均值（es和ET）。:es=1g—1（Exs/4）et=1g—1（Ext/4）Q其中XS和XT分別是系列溶液C和溶液B的反應終點濃度的對數值（1g）。當es為0.5入——兩個入（包括0.5入和2入），et為0.5es-2es（包括0.5es和2es）時，認為供試品在此濃度下沒有干擾效應。如果試驗溶液在小于MVD的稀釋倍數下干擾試驗，則應進一步稀釋試驗溶液，使其不超過MVD，然后重復干擾試驗?！醣?凝膠法干擾試驗溶液的制備內毒素濃度/內毒素溶液配制號/供試品溶液稀釋系數濃度-1248c2入/檢驗水1248-2入入244444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444444零點二五入二入一入零點五入零點二五入D無/檢驗水-2注：A為試驗溶液；B為干擾測試系列；C是鱟試劑標記靈敏度的對照系列；D為陰性對照。可通過對供試品進行更大倍數的稀釋或通過其他適宜的方法（如過濾、中和、透析或加熱處理等）排除干擾。為確保所選擇的處理方法能有效地排除干擾且不會使內毒素失去活性，要使用預先添加了標準內毒素再經過處理的供試品溶液進行干擾試驗。新藥進行內毒素檢查前，或對沒有內毒素檢查項目的品種建立內毒素檢查方法時，必須進行干擾試驗。當鱟試劑、供試品的配方、生產工藝改變或試驗環(huán)境中發(fā)生了任何有可能影響試驗結果的變化時，須重新進行干擾試驗。檢驗方法（1）凝膠限量試驗根據表2制備溶液a、B、C和d。使用稀釋倍數為MVD的供試品溶液制備溶液A和B,干擾已消除。按鱟試劑靈敏度復核試驗操作。表2凝膠限量試驗溶液的制備編號：ABCD內毒素濃度/制備內毒素的溶液/無供試品溶液2入/供試品溶液2入/無供檢查的水/2222供檢查的水平管注：A為供試品溶液；為B供試品陽性對照；C為陽性對照;D為陰性對照?！踅Y果判斷保溫60分鐘±2分鐘后觀察結果。若陰性對照溶液d的平行管均為陰性，供試品陽性對照溶液b的平行管均為陽性，陽性對照溶液c的平行管均為陽性，試驗有效?！跞绻芤篴的兩個平行管均為陰性，則判斷供試品符合要求；如果溶液a的兩個平行管均呈陽性，則判斷供試品不符合要求。如果溶液a的兩個平行管中的一個為陽性，另一個為陰性，則需要重新測試。復測時，溶液A應制作四個平行管，如果所有平行管均為陰性，則應判定供試品符合要求；否則，判定供試品不符合要求。（2）凝膠半定量試驗該方法通過測定反應終點濃度來量化試樣中的內毒素含量。根據表3制備溶液a、B、C和d。按鱟試劑靈敏度復核試驗操作?！醣?凝膠半定量試驗溶液的制備No.a內毒素濃度/制備內毒素的無溶液/供試品溶液1248bc2入/供試品溶液2入/檢驗水11248dNo/檢驗水-內毒素濃度-2入2入1入平行管的數量為2222,檢查用水為0.5入零點二五入一注：A為不超過MVD且通過干擾試驗的試液。從通過干擾試驗的稀釋倍數開始，用檢查水稀釋至1、2、4和8倍，最終稀釋不得超過MVD?！鮞為2入濃度標準內毒素的溶液a（供試品陽性對照）。c為鱟試劑標示靈敏度的對照系列。d為陰性對照?！踅Y果如果陰性對照溶液D的平行管為陰性，供試品陽性對照溶液B的平行管為陽性，且系列溶液C的反應終點濃度的幾何平均值為0.5入一2入，則試驗有效?！跸盗腥芤篴中每一系列平行管的終點稀釋倍數乘以入，為每個系列的反應終點濃度，所有平行管反應終點濃度的幾何平均值即為供試品溶液的內毒素濃度（按公式ce=1g-1（￡x/2）〕。如果檢驗時采用的是供試品的稀釋液，則計算原始溶液內毒素濃度時要將結果乘以稀釋倍數。如果試驗中試驗溶液的所有平行管均為陰性，則應記錄內