mdrl外排泵在單核細胞增生李斯特菌對苯扎氯銨的耐藥機制

mdrl外排泵在單核細胞增生李斯特菌對苯扎氯銨的耐藥機制

季銨鹽酸鹽（quaternam）消毒劑，尤其是苯丙烯酸鹽酸鹽（bc），在食品行業(yè)中得到了廣泛應用。單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes,Lm)是一種重要的食源性致病菌。Lm能在低溫、高鹽、長時間干燥以及酸等多種不利環(huán)境條件下生存和繁殖,導致食品在加工和保藏過程中易受其污染。通過攝入污染的食品可引起李斯特菌病(Listeriosis)的散収和暴収流行外排泵在細菌中廣泛存在,屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白。研究表明,一些外排泵可以將消毒劑、抗生素、重釐屬等作為底物排出體外,使菌體內(nèi)的藥物濃度始終維持在較低水平,從而導致細菌產(chǎn)生耐藥性本研究以Lm標準菌株EGD-e為研究對象,利用同源重組技術構建mdrL基因缺失突變株,通過檢測野生株和突變株在BC脅迫下的生理行為和細胞表面形態(tài)等,調(diào)查MdrL外排泵在Lm對BC耐受中的作用,為闡明Lm對BC的耐受機制奠定理論基礎。1材料和方法1.1大腸桿菌dh5、dh10bLm標準菌株EGD-e和質(zhì)粒pERL3由華中師范大學羅勤教授惠贈;大腸桿菌DH5α、DH10B購自北京博邁德基因技術有限公司;穿梭質(zhì)粒pMAD由本實驗室保存。1.2實驗試劑與儀器苯扎氯銨,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;利血平和溴化乙錠(Ethidiumbromide,EB),美國Sigma-Aldrich公司;細菌基因組DNA提取試劑盒和質(zhì)粒小提試劑盒,北京天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒、PCR產(chǎn)物純化試劑盒、T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶,ThermoFisherScientific公司;TaqDNA聚合酶和dNTPs,寶生物工程(大連)有限公司;引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。電熱恒溫培養(yǎng)箱,北京科偉永興儀器有限公司;氣浴恒溫振蕩器,釐壇天竟實驗儀器廠;基因擴增儀,北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司;電泳儀,北京市六一儀器廠;離心機,上海安亭科學儀器廠;凝膠成像分析系統(tǒng)、電轉(zhuǎn)儀,美國Bio-Rad公司;實時熒光定量PCR儀,瑞士Roche公司;微生物全自動生長曲線分析儀,芬蘭OyGrowthCurvesAbLtd.;透射電鏡,日本HITACHI公司。1.3fphi公司的紡粘設備腦心浸液培養(yǎng)基(Brainheartinfusion,BHI),北京陸橋生物技術有限公司;LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0,酵母提取物5.0,NaCl10.0。1.4方法1.4.1mdrpl基因回復突變株的構建以EGD-e基因組DNA為模板,分別用mdrL-A/mdrL-B和mdrL-C/mdrL-D兩對引物擴增mdrL基因的上、下游同源臂,引物序列見表1。利用重疊延伸PCR(Splicingbyoverlapextension,SOE-PCR)技術采用青霉素G法制備EGD-e感受態(tài)細胞PCR擴增含有啟動子區(qū)域的mdrL基因,PCR反應體系(50μL):5×PSbuffer10μL,2.5mmol/LdNTPs4μL,10μmol/L上、下游引物各3μL,PrimeSTARHSDNApolymerase0.5μL,DNA1.5μL,超純水補足50μL。PCR反應條件:95°C5min;95°C40s,48°C15s,72°C90s,30個循環(huán);72°C7min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)SalI和XhoI雙酶切后與質(zhì)粒pERL3連接,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B中,在含有紅霉素(300μg/mL)的LB平板上培養(yǎng),通過菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切驗證篩選出含有重組質(zhì)粒pERL3-mdrL的陽性兊隆,將陽性轉(zhuǎn)化株送至北京博邁德基因技術有限公司迚行測序。將測序正確的重組質(zhì)粒pERL3-mdrL電轉(zhuǎn)至ΔmdrL感受態(tài)細胞中,篩選得到回復突變株CΔmdrL。同時將質(zhì)粒pERL3電轉(zhuǎn)至ΔmdrL作為對照菌株(ΔmdrL-pERL3)。1.4.2最小抑菌濃度測定按照美國臨床實驗室標準協(xié)會(Clinicalandlaboratorystandardsinstitute,CLSI)推薦的瓊脂稀釋法測定菌株對BC的最小抑菌濃度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)1.4.3同刺激下的生長曲線利用微生物全自動生長曲線分析儀測定野生株EGD-e和突變株ΔmdrL在不同刺激下的生長曲線。每株菌分別挑取5個單兊隆接種至BHI液體培養(yǎng)基中,37°C、150r/min培養(yǎng)過夜。過夜培養(yǎng)物按1:100分別接種至新鮮的BHI、BHI+BC(2μg/mL)、BHI+利血平(20μg/mL1.4.4采用平板法檢測蘑菇對bc的耐藥性挑取野生株EGD-e和突變株ΔmdrL接種于BHI液體培養(yǎng)基,37°C、150r/min培養(yǎng)至OD1.4.5死亡曲線的測量野生株EGD-e和突變株ΔmdrL在37°C、150r/min培養(yǎng)至OD1.4.6細胞培養(yǎng)和培養(yǎng)野生株EGD-e和突變株ΔmdrL接種至3mLBHI液體培養(yǎng)基中,37°C、150r/min培養(yǎng)至對數(shù)中期,離心(4000×g,5min)收集細胞;PBS洗滌2次;PBS懸浮細胞至ODEB的積累:向菌懸液中加入EB(終濃度為8μg/mL),置于實時熒光定量PCR儀,選擇激収波533nm,収射波572nm,37°C循環(huán)60次,每個循環(huán)的第51-60s采集信號1.4.7細胞培養(yǎng)液制備將處于對數(shù)期的野生株和突變株用戊二醛(10%)迚行固定,室溫放置2h;離心收集細胞,用無菌水洗滌2次;加入1mL無菌水懸浮細胞。取5μL菌液置于銅網(wǎng)上,孵育2min;然后滴加5μL磷鎢酸染色15s,徹底晾干后上透射電鏡觀察。1.4.8數(shù)據(jù)分析利用Origin8.5軟件對所得的實驗數(shù)據(jù)迚行雙尾t檢驗分析。2結果與分析2.1egd-e在利血平對生長的影響在含有利血平的BHI培養(yǎng)基中,EGD-e仍能生長(圖1A)。在含有BC的BHI培養(yǎng)基中,EGD-e的LPD變長;而在此基礎上加入利血平后,EGD-e的生長完全受到抑制(圖1B)。結果表明,外排泵在Lm對BC耐受中起至關重要的作用。2.2egd-e+mad-mdral+k-ma通過SOE-PCR得到1235bp的上、下游同源臂融合片段,與預期結果一致(圖2A)。重組質(zhì)粒pMAD-ΔmdrL經(jīng)雙酶切驗證正確后電轉(zhuǎn)至EGD-e感受態(tài)中(圖2B)。篩選得到的陽性菌株用檢測引物只能擴增出1471bp的片段(圖2C)。測序結果表明已缺失mdrL基因獲得ΔmdrL突變株。2.3重組質(zhì)粒peterl3-mdl的表達按照1.4.1的斱法構建回復突變株,通過PCR擴增得到含啟動子的mdrL基因,與預期結果一致(圖3A)。通過菌液PCR和質(zhì)粒雙酶切驗證篩選出含有重組質(zhì)粒pERL3-mdrL的陽性兊隆(圖3B);測序結果顯示,陽性兊隆的序列與野生株EGD-e的完全一致,將重組質(zhì)粒pERL3-mdrL電轉(zhuǎn)至ΔmdrL感受態(tài)細胞中,篩選得到回復突變株CΔmdrL。同時將質(zhì)粒pERL3電轉(zhuǎn)至ΔmdrL作為對照菌株(ΔmdrL-pERL3)。2.4機械干擾試驗野生株EGD-e和突變株ΔmdrL對BC的MIC值均為6μg/mL。mdrL的缺失幵不影響菌株對BC的MIC值,這與我們預期的結果不同,可能是由于瓊脂稀釋法的靈敏度低,不足以反映野生株和突變株在表型上的差異。2.5mdr基因回補野生株EGD-e和突變株ΔmdrL在BHI培養(yǎng)基中的生長情況沒有明顯差異(圖4A)。然而加入BC后,ΔmdrL的LPD明顯變長,為EGD-e的1.56倍;而ΔmdrL的MMGR和MMOD則分別降低為EGD-e的62%和80%(圖4B,表2)。以上結果表明mdrL基因與Lm在BC脅迫下的生長有關。將mdrL基因回補后,菌株在BC存在下的生長恢復至野生株的水平(圖4B);對照菌株ΔmdrL-pERL3的生長曲線與突變株相似(圖4)。這些結果表明突變株在BC脅迫下的生長缺陷只與mdrL基因的敲除有關,排除極性效應的影響。2.6綜合分析的結果經(jīng)檢測,野生株EGD-e和突變株ΔmdrL的初始菌液的菌落總數(shù)分別為2.41×102.7突變株與野生株存活率的比較致死濃度BC(16μg/mL)作用下,野生株EGD-e和突變株ΔmdrL的存活率表現(xiàn)出明顯差異(圖6)。BC作用30min后,野生株和突變株的平均存活率分別為1.96%和0.0065%。與野生株相比,突變株在BC刺激下的存活能力顯著降低。2.8葡萄糖加入對eb的外排能力野生株EGD-e和突變株ΔmdrL對EB的積累無明顯差異(圖7A)。不加葡萄糖時,野生株EGD-e和突變株ΔmdrL對EB的外排不明顯;葡萄糖的加入提高了菌株對EB的外排能力,幵且野生株EGD-e和突變株ΔmdrL對EB的外排能力幾乎一致(圖7B)。結果表明,MdrL外排泵與EGD-e對EB的積累和外排無關。2.9生長曲線egd-e由圖8可知,無BC刺激時,野生株EGD-e與突變株ΔmdrL的形態(tài)無明顯差異(圖8A、B)。加入BC后,野生株EGD-e的細胞形態(tài)無明顯變化(圖8C);而突變株ΔmdrL的細胞明顯變細長(圖8D)。3mdrl外排泵在lm對bc-b外排泵屬于膜轉(zhuǎn)運蛋白,在細菌中廣泛存在。除了參與細胞的正常物質(zhì)運輸和代謝,外排泵還能夠去除細菌細胞和胞膜中的有害物質(zhì),