電針對焦慮大鼠模型下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

電針對焦慮大鼠模型下丘腦-垂體-腎上腺軸的影響

焦慮障礙嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量。針灸和莫哈布西翁治療可以取得明確的療效，但效果機(jī)制尚不清楚。內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)在應(yīng)激焦慮發(fā)生中起重要作用，海馬有高密度表達(dá)的大麻素受體下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)（hypothalamicpituitary-adrenal,HPA）軸是人體應(yīng)激反應(yīng)的關(guān)鍵通路,其活動(dòng)受海馬精細(xì)調(diào)控。目前公認(rèn)的機(jī)制是HPA軸功能持續(xù)亢進(jìn)，體內(nèi)糖皮質(zhì)激素（glucocorticoid,GC）水平過度升高，從而導(dǎo)致相應(yīng)部位的病理損傷。因此推測：海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)調(diào)控HPA軸在電針治療應(yīng)激所致焦慮障礙中發(fā)揮重要作用。本研究探討電針作用后海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)變化，闡明其對HPA軸相關(guān)神經(jīng)內(nèi)分泌因子和受體的調(diào)節(jié)以及在電針緩解應(yīng)激所致焦慮行為改變中的作用。1材料和方法1.1動(dòng)物房模式1本實(shí)驗(yàn)采取4～8周的雌性SD大鼠，SPF級（合格證編號：20180004019270），體重200～220g，每只籠位飼養(yǎng)4～6只大鼠，按照國家部屬實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)制訂的標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，動(dòng)物房溫度23～25°C，相對濕度40%～50%，光照時(shí)間7∶00～19∶00；所有大鼠均都經(jīng)過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理機(jī)構(gòu)的許可，并遵循了上海中醫(yī)藥大學(xué)所制訂的有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和使用的指南。1.2elisa試驗(yàn)AM-251(MCE生產(chǎn)，貨號：HY-15443）；針灸針（蘇州醫(yī)療用品有限公司，0.35mm×13mm）；促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0565R1）；皮質(zhì)醇（CORT)ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0559R1）；促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH)ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司，MM-0520R1）；糖皮質(zhì)激素（GC)ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司生產(chǎn)，MM-0986R1）。1.3儀器、檢測方法大鼠自發(fā)活動(dòng)箱（上海昆盟生物科技有限公司）；高架十字迷宮（上海昆盟生物科技有限公司）；束縛裝置（上海昆盟生物科技有限公司）；電針儀（上海華誼醫(yī)用儀器，BT701-1B）；全波長酶標(biāo)儀（Thermo,multiskanGO）；全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟雪科，MS-20）；超低溫冷凍儲(chǔ)存箱（美菱，DW-HL528S）。1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1大鼠焦慮模型的建立采用單次延長應(yīng)激法建立術(shù)前焦慮模型1.4.2針刺前干預(yù)方法具體分組如下（每組12只）。對照組（正常飼養(yǎng)不做處理）；模型組（單次延長應(yīng)激法焦慮模型）；假電針組（穴位附近刺淺表，留針不通電）；電針組（針刺百會(huì)、神門、內(nèi)關(guān)、印堂，2Hz,1mA，持續(xù)15min);E:AM251(1mg/kg體重，針刺前30min腹腔注射）+電針組（穴位同電針組）；F:AM251+假電針組（方法同假電針組）。造模結(jié)束后的次日，開始對大鼠進(jìn)行針灸及藥物干預(yù)。對于針灸組的大鼠，主要參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》和《大鼠穴位圖譜的研制》1.4.3調(diào)查試驗(yàn)的滯后(1)曠場實(shí)驗(yàn)（openfieldtest）。針灸干預(yù)3次后的次日進(jìn)行曠場試驗(yàn)。觀察指標(biāo)：通過觀察大鼠爬行中央格次數(shù)與時(shí)間、外周格次數(shù)與時(shí)間以及運(yùn)動(dòng)的總距離，計(jì)算出爬行的總格數(shù)、中央格爬行次數(shù)占爬行總格數(shù)的比例以及中央格停留時(shí)間占總時(shí)間的百分比1.5統(tǒng)計(jì)方法采用GraphPad7進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖片數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（2結(jié)果2.1開放臂停留時(shí)間比較通過曠場實(shí)驗(yàn)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)評估大鼠焦慮行為，相對于對照組，模型組大鼠邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長，開放臂停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與模型組比較，電針組中可見邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間縮短而開放臂停留時(shí)間明顯延長（P<0.05）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組大鼠邊緣區(qū)域運(yùn)動(dòng)時(shí)間延長，開放臂停留時(shí)間縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見圖1。2.2各組大鼠血清中表達(dá)蛋白的比較相對于對照組，模型組血清ACTH、CORT、CRH、GC蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，電針組可以明顯抑制上述蛋白在血清中表達(dá)，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與電針組比較，假電針組、AM251+電針組血清ACTH、CORT、CRH、GC蛋白釋放明顯增加，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見圖2。3討論3.1中醫(yī)金針菇聯(lián)合金針菇應(yīng)激是指大腦在應(yīng)對確定事件或環(huán)境時(shí)所表現(xiàn)出來的反應(yīng)，慢性應(yīng)激會(huì)產(chǎn)生一些有害的影響中醫(yī)針灸可以緩解焦慮障礙改善焦慮情緒，尤其是對軀體癥狀3.2中醫(yī)針灸激活的內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)ceb的緩解焦慮機(jī)制中醫(yī)按照病情癥狀，將焦慮癥歸屬于情志病的范疇3.3hpa軸在焦慮本研究通過ELISA觀察HPA軸變化，主要通過測得血清中ACTH、CORT、CRH、GC含量來反映出單次延長應(yīng)激對成年老鼠HPA軸的影響以及電針是否可以減輕其釋放，阻斷電針調(diào)配受體是否可以干預(yù)電針對HPA軸的影響。HPA軸是機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)過程的中樞，CRH、ACTH、CORT三者在HPA軸上相互關(guān)聯(lián)、相互影響。人體受到應(yīng)激刺激時(shí)，CRH可隨著門脈系統(tǒng)的血液進(jìn)入后垂體前葉，作用于垂體前葉使其釋放ACTH，導(dǎo)致CORT的分泌增加本研究探討電針作用后海馬內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)變化，通過構(gòu)