大豆制品中尿素酶活性測定方法

大豆制品中尿素酶活性測定方法適用范圍本標準適用于由大豆制得的產品和副產品中尿素酶活性的測定。本法可確認大豆制品的濕熱處理程度。定義本標準所指尿素酶活性定義如下：在30±0.5°C和pH7的條件下，每分鐘每克大豆制品分解尿素所釋放的氨態(tài)氮的毫克數(shù)。原理將粉碎的大豆制品與中性尿素緩沖溶液混合，在30C保持30min,尿素酶催化尿素水解產生氨的反應。用過量鹽酸中和所產生的氨，再用氫氧化鈉標準溶液回滴。儀器設備樣品篩：孔徑200um;酸度計：精度0.02pH,附有磁力攪拌器和滴定裝置；恒溫水?。嚎煽販?0±0.5C;試管：直徑18mm,長150mm,有磨口塞子；精密計時器；粉碎機：粉碎時應不生強熱(例如球磨機)分析天平：感量0.1mg;移液管：10ml。試劑和溶液尿素(GB696-77)：分析純；磷酸氫二鈉缶81263-77)：分析純；磷酸二氫鉀(GB1274-77)：分析純；尿素緩沖溶液(pH6.9至7.0):4.45g磷酸氫二鈉(5.2)和3.40g磷酸二氫鉀(5.3)溶于水并稀釋至1000ml,再將30g尿素(5.1)溶于此緩沖溶液中，可保存1個月。鹽酸(GB622-77):分析純，0.1M溶液；氫氧化鈉(GB629-77):分析純，0.1M標準溶液，按GB601標準溶液制備方法的規(guī)定配制。試樣的制備用粉碎機(4.6)將10g試樣粉碎，使之全部通過樣品篩(4.1)。對特殊試樣(水分或揮發(fā)物含量較高而無法粉碎的產品)應先在實驗室溫度下進行預干燥，再進行粉碎，當計算結果時應將干燥失重計算在內。測定步驟稱取約0.2g已粉碎的試樣，稱準至0.1mg,轉入試管(4.4)中(如活性很高只稱0.05g試樣)移入10ml尿素緩沖溶液(5.4),立即蓋好試管并劇烈搖動，馬上置于30±0.5°C恒溫水浴(4.3)中，準確計時保持30min。即刻移入10ml鹽酸溶液(5.5),迅速冷卻到20C。將試管內容物全部轉入燒杯，用5ml水沖洗試管兩次，立即用氫氧化鈉標準溶液(5.3)滴定至pH4.70。另取試管作空白試驗，移入10ml尿素緩沖液(5.4),10ml鹽酸溶液(5.5)。稱取與上述試樣量相當?shù)脑嚇?，也稱準至0.1mg,迅速加入此試管中。立即蓋好試管并劇烈搖動。將試管置于30±0.5C的恒溫水浴，同樣準確保持30min,冷卻至20C,將試管內容物全部轉入燒杯，用5ml水沖洗試管兩次，并用氫氧化鈉標準溶液(5.3)滴定至pH4.70。測定結果的計算8.1 計算方法以每分鐘每克大豆制品釋放氮的毫克量表示的尿素酶活U,按下式計算：14XC(V0-V)30Xm式中：C—氫氧化鈉標準溶液摩爾濃度，mol/L;V0—空白試驗消耗氫氧化鈉溶液體積，ml;V一測定試樣消耗氫氧化鈉溶液的體積，ml;m—試樣質量，g。注：若試樣經(jīng)粉碎前的預干燥處理時，則14XC(V0-V)U= X(l-S)30Xm式中：S—預干燥時試樣失重的百分率。8.2重復性同一分析人員用相同方法，同時或連續(xù)兩次測定結果之差不超過平均10%,以其算術平均值報告結果。備注：尿素一苯酚紅試劑法(快速定性檢測)該法是指在指示劑苯酚紅存在的條件下，以尿素轉變成氨的多少及顯色度，定性測定豆粕中脲酶活性，進而確定豆粕生熟度的一種方法。檢測方法：取粉碎豆粕粉少許，均勻地平鋪于表面皿中。用滴管吸取尿素一苯酚磺指示劑(苯酚紅溶于溶液中，用蒸餾水稀釋至300ml；加入90g尿素，溶解后再用蒸餾水稀釋至2000ml；加；稀釋至3000ml)浸濕表面皿上的被檢樣，5min后觀察結果：無任何紅點出現(xiàn)，再放置25min，若仍無紅點出現(xiàn)，說明被檢餅粕無脲酶活性，是餅粕加工過熟表現(xiàn)。有少數(shù)紅點，或表面被25%?50%紅點覆蓋，說明豆粕脲酶活性弱，餅粕可用。當餅粕表面75%?100%被紅點覆蓋，說明脲酶活性很強，餅粕生，需加熱處理才可利用。注：尿素一苯酚磺指示劑應呈明亮琥珀色，若呈橘紅色，調整。該液最好現(xiàn)配現(xiàn)用。判斷結果一般變紅時間為5?25min之間，豆粕表面積約有1/4為紅色覆蓋，則尿素酶中度活性，豆粕加工適中，品質較好；若＜5min變紅，有1/2