細(xì)菌基因組DNA的提取

分離純化核酸總標(biāo)準(zhǔn)：①應(yīng)確保核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)完整性；②排除其它分子污染。核酸純化應(yīng)到達(dá)要求：①核酸樣品中不應(yīng)存在有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度金屬離子；②其它生物大分子污染應(yīng)降低到最低程度；③排除其它核酸分子污染。2、核酸制備普通標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌基因組DNA的提取第1頁(yè)核酸制備時(shí)應(yīng)注意事項(xiàng):①盡可能簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取時(shí)間。②降低化學(xué)原因?qū)怂峤到?。③降低物理原因?qū)怂峤到猓簷C(jī)械剪切力和高溫④預(yù)防核酸生物降解。

細(xì)菌基因組DNA的提取第2頁(yè)核酸制備步驟：破碎細(xì)胞提取純化細(xì)菌基因組DNA的提取第3頁(yè)核酸酶抑制和抑制劑

降低溫度，改變pH及鹽濃度，都利于對(duì)核酸酶活性抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個(gè)條件并用更加好。對(duì)于DNA，抑制DNase活力很輕易，但預(yù)防機(jī)械張力拉斷則更主要。對(duì)于RNA，因分子較小，不易被機(jī)械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更主要。3、核酸制備普通方法和原理細(xì)菌基因組DNA的提取第4頁(yè)DNase抑制

①加入少許金屬離子螯合劑，如0.01mol/LEDTA或檸檬酸鈉，DNase基本能夠全部失活。②去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。細(xì)菌基因組DNA的提取第5頁(yè)RNase抑制①操作要帶手套。②全部器皿要嚴(yán)格消毒，③試劑處理④低溫操作⑤在分離過(guò)程中要加入一定RNase抑制劑。

細(xì)菌基因組DNA的提取第6頁(yè)核酸制備中慣用去垢劑

核酸本身帶負(fù)電荷，結(jié)合帶正電荷蛋白質(zhì)。用于核酸提取去垢劑，普通都是陰離子去垢劑，去垢劑作用：

1．溶解膜蛋白及脂肪，使細(xì)胞膜破裂；

2．溶解核小體上蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來(lái)；

3．對(duì)RNase、DNase有一定抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉細(xì)菌基因組DNA的提取第7頁(yè)核酸制備中慣用蛋白質(zhì)變性劑

1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。

2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。

3.一些蛋白質(zhì)變性劑也有抑制RNase活性和破裂細(xì)胞作用。

如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC細(xì)菌基因組DNA的提取第8頁(yè)核酸制備中慣用酶

DNaseRNase

蛋白酶K

溶菌酶

細(xì)菌基因組DNA的提取第9頁(yè)

細(xì)胞破碎

抽提去蛋白質(zhì)沉淀核酸核酸提取普通過(guò)程細(xì)菌基因組DNA的提取第10頁(yè)細(xì)胞破碎機(jī)械方法：超聲波處理法、研磨法、勻漿法；化學(xué)試劑法：用SDS處理細(xì)胞；酶解法：加入溶菌酶或蝸牛酶，破壞細(xì)胞壁。DNA提取

SDS（十二烷基硫酸鈉）法：SDS是有效陰離子去垢劑,細(xì)胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合,SDS能夠破壞這種價(jià)鍵。

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）法：CTAB是一個(gè)陽(yáng)離子去垢劑，它能夠溶解膜與脂膜，使細(xì)胞中DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物釋放出來(lái)，并使蛋白質(zhì)變性，使DNA與蛋白質(zhì)分離。DNA純化（去雜質(zhì)）蛋白質(zhì)：慣用苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）或氯仿：異戊醇（24：1）抽提。

RNA：常選取RNase消化，或是用LiCl來(lái)消除大分子RNA。酚類物質(zhì)：提取液中加少許巰基乙醇，選取幼嫩材料。多糖：提取液中加1％PVP。

核酸提取普通過(guò)程細(xì)菌基因組DNA的提取第11頁(yè)核酸樣品保留溫度：

4℃（5℃）最正確和最簡(jiǎn)單

-70℃是長(zhǎng)久保留良好溫度，為一次性保留

-20℃保留保留介質(zhì)：

TE緩沖溶液(最慣用)10mmol/LTris-ClpH8.01mmol/LEDTApH8.0細(xì)菌基因組DNA的提取第12頁(yè)二、材料、設(shè)備及試劑

菌種：大腸桿菌設(shè)備：eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，臺(tái)式高速離心機(jī)，渦旋振蕩器，水浴鍋（37℃

、60℃

）試劑：LB液體培養(yǎng)基、RNA酶A、無(wú)水乙醇無(wú)菌水（或TE）緩沖液、10%SDS、20mg/ml蛋白酶K，、5mol/LNaCl、酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）、異丙醇、75%乙醇、CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加熱到65度溶解。）細(xì)菌基因組DNA的提取第13頁(yè)1、培養(yǎng)5ml細(xì)菌培養(yǎng)物至飽和狀態(tài)，取1.2ml培養(yǎng)物離心1rpm,1min。2、沉淀物加入570ul無(wú)菌水（或TE）緩沖液，用吸管重復(fù)吹打使之重懸。加入30ul10%SDS和10ul20mg/ml蛋白酶K，混勻，于37℃溫育1h，（加入3ul溶菌酶50mg/ml效果更加好）。3、加入100ul5mol/LNaCl,充分混勻，再加入80ulCTAB/NaCl溶液，混勻，于60℃溫育10min。(上下顛倒混勻)，離心，1rpm,5min。4、取上清，加入等體積（約800ul）酚：氯仿：異戊醇（25：24：1），混勻，離心1rpm,5min，將上清液轉(zhuǎn)至新管中。（抽提兩次）5、加入0.6體積異丙醇，輕輕混合直到DNA沉淀下來(lái)，靜止10分鐘，離心,1rpm,10min。6、沉淀用1ml75%乙醇中洗滌，離心5min，棄上清液，重懸于30ul無(wú)菌水（或TE）緩沖液。三、操作步驟細(xì)菌基因組DNA的提取第14頁(yè)四、注意事項(xiàng)——材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保留樣品材料不要重復(fù)凍融細(xì)菌基因組DNA的提取第15頁(yè)四、注意事項(xiàng)——細(xì)胞裂解材料應(yīng)適量，過(guò)多會(huì)影響裂解，造成DNA量少，純度低針對(duì)不一樣材料，選擇適當(dāng)裂解預(yù)處理方式：植物材料－－液氮研磨動(dòng)物組織－－勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞－－蛋白酶K細(xì)菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時(shí)，定時(shí)輕