酶聯(lián)免疫法原理及操作

酶聯(lián)免疫法原理及操作酶聯(lián)免疫法原理及操作第1頁1.

ELISA原理2.

ELISA類型3.試劑準(zhǔn)備：免疫吸附劑結(jié)合物酶底物準(zhǔn)備4.對照設(shè)定5.標(biāo)本采取和保留6.結(jié)果判斷

酶聯(lián)免疫法原理及操作第2頁ELISA是一個免疫測定（immunoassay，IA）?；A(chǔ):抗原或抗體固相化及抗原或抗體酶標(biāo)識。加入酶反應(yīng)底物后，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)量直接相關(guān)，由此進(jìn)行定性或定量分析。1.

ELISA原理酶聯(lián)免疫法原理及操作第3頁酶免疫測定類型

這種固相酶免疫測定方法在1971年最初建立時稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測定（EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay），簡稱ELISA。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均相酶免疫測定非均相酶免疫測定固相酶免疫測定液相酶免疫測定酶聯(lián)免疫法原理及操作第4頁1.1抗原抗體反應(yīng)

1.1.1可逆性

抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物過程是一個動態(tài)平衡，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab

抗體親和力（affinity），能夠用平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab解離程度與K值相關(guān)。高親和力抗體抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，二者結(jié)合牢靠，不易解離。解離后抗原或抗體均能保持原有結(jié)構(gòu)和活性。酶聯(lián)免疫法原理及操作第5頁1.1.2特異性

抗原抗體結(jié)合發(fā)生在抗原決定簇與抗體結(jié)合位點(diǎn)之間?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型互補(bǔ)關(guān)系，含有高度特異性。

測定某一特定物質(zhì)，而不需先分離待檢物。

酶聯(lián)免疫法原理及操作第6頁1.1.3最適百分比

酶聯(lián)免疫法原理及操作第7頁1.1.4敏感性化學(xué)比色法敏感度為mg/ml水平酶反應(yīng)測定法敏感度約為5-10μg/ml免疫測定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法敏感度與酶反應(yīng)法相仿標(biāo)識免疫敏感度可提升數(shù)千倍，達(dá)ng/ml水平比如，HBsAg，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。酶聯(lián)免疫法原理及操作第8頁1.4免疫測定在臨床檢驗中應(yīng)用因為各種抗原成份，包含小分子半抗原，均可用以制備特異性抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測標(biāo)本中對應(yīng)抗原，所以免疫測定應(yīng)用范圍極廣。酶聯(lián)免疫法原理及操作第9頁2

ELISA類型ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有三個必要試劑：（1）固相抗原或抗體，即"免疫吸附劑"（immunosorbent）；（2）酶標(biāo)識抗原或抗體，稱為"結(jié)合物"（conjugate）；（3）酶反應(yīng)底物?？稍O(shè)計出各種不一樣類型檢測方法。酶聯(lián)免疫法原理及操作第10頁2.2.1雙抗體夾心法測抗原此法適合用于檢驗各種蛋白質(zhì)等大分子抗原，比如HBsAg、HBeAg、AFP等。只要取得針對受檢抗原異性抗體，就可用于包被固相載體和制備酶結(jié)合物而建立此法。酶聯(lián)免疫法原理及操作第11頁2.2.2雙抗原夾心法測抗體

用特異性抗原進(jìn)行包被和制備酶結(jié)合物。此法中受檢標(biāo)本不需稀釋，可直接用于測定，所以其敏感度相對高于間接法。乙肝標(biāo)志物中抗HBsAg檢測常采取本法。本法關(guān)鍵在于酶標(biāo)抗原制備，應(yīng)依據(jù)抗原結(jié)構(gòu)不一樣，尋找適當(dāng)標(biāo)識方法。酶聯(lián)免疫法原理及操作第12頁2.2.3間接法測抗體

傳染病診療。間接法優(yōu)點(diǎn)是只要變換包被抗原就可利用同一酶標(biāo)抗抗體建立檢測對應(yīng)抗體方法。酶聯(lián)免疫法原理及操作第13頁2.2.4競爭法測抗體

當(dāng)抗原材料中干擾物質(zhì)不易除去，或不易得到足夠純化抗原時，可用此法檢測特異性抗體。

酶聯(lián)免疫法原理及操作第14頁2.2.5競爭法測抗原

小分子抗原或半抗原缺乏可作夾心法兩個以上位點(diǎn)，所以不能用雙抗體夾心法進(jìn)行測定，能夠采取競爭法模式。其原理是標(biāo)本中抗原和一定量酶標(biāo)抗原競爭與固相抗體結(jié)合。標(biāo)本中抗原量含量愈多，結(jié)合在固相上酶標(biāo)抗原愈少，最終顯色也愈淺。小分子激素、藥品等ELISA測定多用此法。

酶聯(lián)免疫法原理及操作第15頁2.2.6捕捉包被法測抗體IgM檢測常見于傳染病診療。用抗人IgM抗體包被固相，以捕捉血清標(biāo)本中IgM（其中包含針反抗原特異性IgM抗體和非特異性IgM）。此法常見于病毒性感染早期診療。酶聯(lián)免疫法原理及操作第16頁2.2.7ABS-ELISA法

①：固相支持物；②：樣品；③：特異性IgG；④：生物素化抗小鼠IgG（Biotin）；⑤：辣根過氧化物酶HRP-酶標(biāo)鏈親和素（Avidin）；⑥：DAB顯色液；⑦：顯色；酶聯(lián)免疫法原理及操作第17頁3.ELISA試劑(A、B、C三個別)ELISA中有三個必要試劑：免疫吸附劑、結(jié)合物和酶底物。（1）已包被抗原或抗體固相載體（免疫吸附劑）；（2）酶標(biāo)識抗原或抗體（結(jié)合物）；（3）酶底物；（4）陰性對照品和陽性對照品，參考標(biāo)準(zhǔn)品；（5）結(jié)合物及標(biāo)本稀釋液；（6）洗滌液；（7）酶反應(yīng)終止液酶聯(lián)免疫法原理及操作第18頁ELISA試劑準(zhǔn)備A

固相載體聚苯乙烯含有較強(qiáng)吸附蛋白質(zhì)性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后仍保留原來免疫學(xué)活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好ELISA板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間、同一板各孔之間、同一板各孔之間性能相近。酶聯(lián)免疫法原理及操作第19頁3.1.2包被方式

將抗原或抗體固定在過程稱為包被(coating)。

蛋白質(zhì)與聚苯乙烯固相載體是經(jīng)過物理吸附結(jié)合，靠是蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)上疏水基團(tuán)與固相載體表面疏水基團(tuán)間作用。這種物理吸附是非特異性，受蛋白質(zhì)分子量、等電點(diǎn)、濃度等影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。酶聯(lián)免疫法原理及操作第20頁不易吸附非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被抗原經(jīng)固相抗體親和層析作用，包被在固相上抗原純度大大提升，所以含雜質(zhì)較多抗原也可采取捕捉包被法。親和素生物素即用親和素先包被載體，加入生物素化DNA，這種包被方法均勻、牢靠，已擴(kuò)充應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)定量測定。脂類物質(zhì)無法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（比如乙醇）中溶解后加入ELISA板孔中，開蓋置冰箱過夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。優(yōu)點(diǎn)：試驗特異性、敏感性均由此得以改進(jìn)，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被1/10乃至于/100。酶聯(lián)免疫法原理及操作第21頁包被用抗原：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原三大類。合成多肽抗原是抗原決定簇氨基酸序列人工合成多肽片段。普通只含有一個抗原決定簇，純度高，特異性也高，但因為分子量太小，往往難于直接吸附于固相上。借助于偶聯(lián)物與固相載體吸附，間接地結(jié)合到固相載體表面。酶聯(lián)免疫法原理及操作第22頁3.1.4包被用抗體IgG對聚苯乙烯有強(qiáng)吸附力，其聯(lián)結(jié)發(fā)生在Fc段上，抗體結(jié)合點(diǎn)暴露于外。取材于抗血清或含單克隆抗體培養(yǎng)液.須除去雜抗體后才能用于ELISA，以確保試驗特異性。腹水中單抗?jié)舛容^高，特異性亦較強(qiáng)，所以不需要作吸收層析處理，直接包被。在一些情況下，用各種單抗混合包被，可取得更加好效果。酶聯(lián)免疫法原理及操作第23頁3.1.5包被條件 pH9.6碳酸鹽緩沖液

pH7.2磷酸鹽緩沖液

pH7-8Tris-HCL緩沖液。加入包被液后，在4-8℃冰箱中放置過夜，37℃中保溫2小時。包被濃度隨載體和包被物性質(zhì)可有很大改變，每批材料需經(jīng)過試驗與酶結(jié)合物濃度協(xié)調(diào)選定。普通蛋白質(zhì)包被濃度為10ng/ml-20ug/ml。酶聯(lián)免疫法原理及操作第24頁3.1.6封閉封閉(blocking)是繼包被之后用高濃度無關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被過程。封閉就是讓大量不相關(guān)蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而排斥ELISA后步驟中干擾物質(zhì)再吸附。常見封閉劑：0.05%-0.5%BSA;10%小牛血清或1%明膠;脫脂奶粉,比較價廉，能夠高濃度使用（5%）。全部ELISA固相均需封閉？酶聯(lián)免疫法原理及操作第25頁3.4洗滌液在板式ELISA中，常見稀釋液為含0.05%吐溫20磷酸鹽緩沖液。酶聯(lián)免疫法原理及操作第26頁

ELISA試劑準(zhǔn)備B

3.2結(jié)合物

即酶標(biāo)識抗體（或抗原）是ELISA中關(guān)鍵試劑

1酶催化活性

2抗體（或抗原）免疫活性

3含有或少含有游離抗體（或抗原）

4結(jié)合物尚要有良好穩(wěn)定性。酶聯(lián)免疫法原理及操作第27頁3.2.1結(jié)合物用抗原和抗體

制備結(jié)合物時所用純度較高IgG，以免在與酶聯(lián)結(jié)時其它雜蛋白干擾。最好用層析純化抗體，這么全部酶結(jié)合物均含有特異免疫活性，能夠在高稀釋度進(jìn)行反應(yīng)，試驗結(jié)果本底淺淡。在ELISA中用酶標(biāo)抗原模式不多，總要求是抗原必須是高純度。酶聯(lián)免疫法原理及操作第28頁3.2.2酶純度高，催化反應(yīng)轉(zhuǎn)化率高，專一性強(qiáng)，性質(zhì)穩(wěn)定，起源豐富，價格不貴，受檢標(biāo)本中不存在相同酶。酶結(jié)合物保留活性個別和催化能力，底物易于制備和保留，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定等。在ELISA中，HRP，AP，葡萄糖氧化酶，β-D-半乳糖苷酶和脲酶等。HRP是一個糖蛋白，含糖量約為18%，分子量為44000，是一個復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成，是一個卟啉蛋白質(zhì)。酶聯(lián)免疫法原理及操作第29頁3.2.3結(jié)合物制備酶標(biāo)識抗體制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過碘酸鹽氧化法。（1）戊二醛交聯(lián)法：戊二醛是一個雙功效團(tuán)試劑，可使酶與蛋白質(zhì)氨基經(jīng)過它而聯(lián)結(jié)。有效（結(jié)合率達(dá)60%-70%）和重復(fù)性好。交聯(lián)反應(yīng)是隨機(jī)，結(jié)合物大小也不均一，酶與酶，抗體與抗體之間也有可能交聯(lián)，影響效果。（2）過碘酸氧化法：適用含糖量較高酶。過碘酸鈉將HRP分子表面多糖氧化為醛基很活潑，可與蛋白質(zhì)上氨基形成chiff氏堿而結(jié)合。簡便有效.酶聯(lián)免疫法原理及操作第30頁

結(jié)合物中混有游離酶普通不影響ELISA中最終酶活性測定。但游離抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭對應(yīng)固相抗原，所以制備酶結(jié)合物應(yīng)予純化，去除游離酶和抗體后用于檢測，效果更加好。制得結(jié)合物，最適工作濃度就是指結(jié)合物稀釋至這一濃度時，能維護(hù)一個低本底，并取得測定最正確靈敏度，到達(dá)最適當(dāng)測定條件和測定費(fèi)用節(jié)約。酶聯(lián)免疫法原理及操作第31頁3.2.4結(jié)合物保留

酶和抗體均為生物活性物質(zhì)，易失活。高濃度較為穩(wěn)定，凍干后可在普通冰箱中保留一年左右。結(jié)合物溶液中加入等體積甘油，加入蛋白保護(hù)劑。另外再加入抗生素（比如慶大霉素）和防腐劑（HRP結(jié)合物加硫柳泵，AP結(jié)合物可加疊氮鈉）。酶聯(lián)免疫法原理及操作第32頁3.2.5結(jié)合物稀釋液

用于稀釋高濃度結(jié)合物以配成工作液。為防止結(jié)合物在反應(yīng)中直接吸附在固相載體上：0.1%牛血清白蛋白，0.05%吐溫20。試劑盒均已用適當(dāng)緩沖液配成工作液，使用時不需再行稀釋，在4-8℃保留期可達(dá)6個月。酶聯(lián)免疫法原理及操作第33頁試劑準(zhǔn)備

C酶底物酶聯(lián)免疫法原理及操作第34頁3.3酶底物3.3.1

HRP底物OPD氧化后產(chǎn)物呈橙紅色，用酸終止酶反應(yīng)后，在492nm處有最高吸收峰，靈敏度高，比色方便，是HRP結(jié)合物最常見底物。DH2+H2O2

D+2H2O

上式中，DH2為供氧體，H2O2為受氫體。DH2普通為無色化合物，經(jīng)酶作用后成為有色產(chǎn)物。DH2如：鄰苯二胺(OPD)、四甲基聯(lián)苯胺(TMB)和ABTS。E酶聯(lián)免疫法原理及操作第35頁TMB經(jīng)HRP作用后共產(chǎn)物顯藍(lán)色。TMB性質(zhì)較穩(wěn)定，可配成溶液試劑，只需與H2O2溶液混和即成應(yīng)用液。酶反應(yīng)終止后，TMB產(chǎn)物由藍(lán)色呈黃色，可在比色計中定量，最適吸收波長為450nm。ABTS雖不如OPD和TMB敏感，但空白值極低，也為一些試劑盒所采取。HRP對氫受體專一性很高，僅作用于H2O2、小分醇過氧化物和尿素過氧化物(ureaperoxide)。酶聯(lián)免疫法原理及操作第36頁AP底物為磷酸酯酶，普通采取對硝基苯磷酸酯作為底物。產(chǎn)物為黃色對硝基酚，在405nm波優(yōu)點(diǎn)有吸收峰。用NaOH終止酶反應(yīng)后，黃色可穩(wěn)定一時間。AP也有發(fā)熒光底物（磷酸4-甲基傘酮），可用于ELISA作熒光測定，敏感度較高于用顯色底物比色法。酶聯(lián)免疫法原理及操作第37頁3.5酶反應(yīng)終止液常見HRP反應(yīng)終止液為硫酸，其濃度按加量及比色液最終體積而異，在板式ELISA中普通采取2mol/L。酶聯(lián)免疫法原理及操作第38頁4對照設(shè)定

陽性對照品(positivecontrol)和陰性對照品(negativecontrol)是檢驗試驗有效性控制品，同時也作為判斷結(jié)果對照。 陽性對照品基礎(chǔ)組成應(yīng)盡可能與檢測標(biāo)本組成相一致，多以含蛋白保護(hù)劑緩沖液為基質(zhì)。 加入量應(yīng)與試劑敏感度相當(dāng)； 在測定中得到吸光值與受檢標(biāo)本吸光值比較，能夠預(yù)計標(biāo)本物質(zhì)量。酶聯(lián)免疫法原理及操作第39頁參考標(biāo)準(zhǔn)品

定量測定（如甲胎蛋白質(zhì)，癌胚抗原測定等）應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包含覆蓋可檢測范圍4-5個濃度，普通均配入含蛋白保護(hù)劑及防腐劑緩沖液中.

陰性對照品須先行檢測確定不含待測物質(zhì)。比如HBsAg檢測陰性對照品中不可含HBsAg，最好抗HBs也是陰性。酶聯(lián)免疫法原理及操作第40頁5標(biāo)本采取和保留

體液、分泌物和排泄物等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。以血清標(biāo)本為例：血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外，其它成份同血清。血漿和血清可同等應(yīng)用。血清標(biāo)本應(yīng)防止溶血：紅細(xì)胞溶解時會釋放出含有過氧化物酶活性物質(zhì)，以HRP為標(biāo)識ELISA測定中，可能會增加非特異性顯色。酶聯(lián)免疫法原理及操作第41頁加樣:

在ELISA中普通有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在LEISA板孔底部，防止加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡?；A(chǔ)操作注意事項酶聯(lián)免疫法原理及操作第42頁保溫抗原抗體完成反應(yīng)保溫過程稱為溫育(incubation)。ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。為何ELISA反應(yīng)總是需要一定時間溫育？溫育常采取溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是試驗室中常見保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合適當(dāng)溫度。酶聯(lián)免疫法原理及操作第43頁保溫方式：ELISA儀器附有特制電熱塊，水浴。若用保溫箱：ELISA板放在濕盒內(nèi)，在盒底墊濕紗布，最終將ELISA板放在濕紗布上。反應(yīng)板均不宜疊放，以確保各板溫度都能快速平衡。室溫溫育反應(yīng)，操作時室溫應(yīng)嚴(yán)格限制在要求范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)室溫溫度是指20-25℃，但詳細(xì)操作時可依聽說明書要求控制溫育。應(yīng)注意溫育溫度和時間應(yīng)按要求力爭準(zhǔn)確。為確保這一點(diǎn)，一個人操作時，一次不宜多于兩塊板同時測定。酶聯(lián)免疫法原理及操作第44頁洗滌洗滌在ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟，但卻也決定著試驗成敗。ELSIA洗滌：到達(dá)分離游離和結(jié)合酶標(biāo)識物目標(biāo)。去除殘留在板孔中游離物質(zhì)，以及非特異性地吸附干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)吸附是普遍性，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附干擾物質(zhì)洗滌下來。能夠說在ELISA操作中，洗滌是最主要關(guān)鍵技術(shù)。洗滌方式除一些ELISA儀器配有特殊自動洗滌儀外，手工操作有流水沖洗式和浸泡式兩種：酶聯(lián)免疫法原理及操作第45頁（1）流水沖洗式流水沖洗法最初用于小珠載體洗滌，洗滌液為蒸餾水，自來水。洗滌效果更為徹底，且也簡便、快速。已經(jīng)有試驗表明，流水沖洗式一樣適合用于微量滴定板洗滌。讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳。

（2）浸泡式微量滴定板多采取。洗滌液為非離子型洗滌劑中性緩沖液。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)結(jié)合是疏水性，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán)，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體。酶聯(lián)免疫法原理及操作第46頁顯色顯色是酶催化無色底物生成有色產(chǎn)物溫育反應(yīng)。反應(yīng)溫度和時間仍是影響顯色原因。在一定時間內(nèi)，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間延長而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提升溫度有利于加速顯色進(jìn)行。TMB受光照影響不大，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)觀察結(jié)果。但為確保試驗結(jié)果穩(wěn)定性，宜在要求適當(dāng)初間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)頂峰，隨即逐步減弱，至2小時后即可完全消退至無色。酶聯(lián)免疫法原理及操作第47頁比色拭干板底附著液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。以蒸餾水校零點(diǎn)，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程孔），以統(tǒng)計此次試驗試劑情況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點(diǎn)，以上各孔吸光度需減去空白孔吸光度，然后進(jìn)行計算。結(jié)果以光密度（oplicaldensity，OD），現(xiàn)按要求用吸光度（absorbence，A），二者含義相同。通常表示方法是，將吸收波長寫于A字母右下角，如OPD吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。酶聯(lián)免疫法原理及操作第48頁酶標(biāo)比色儀酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀，通常指測讀ELISA光度計。針對固相載體形式不一樣，各有特制適合用于板、珠和小試管設(shè)計。酶標(biāo)儀主要性能指標(biāo)有：測讀速度、讀數(shù)準(zhǔn)確性、重復(fù)性、準(zhǔn)確度和可測范圍、線性等等。優(yōu)良酶標(biāo)儀讀數(shù)普通可準(zhǔn)確到0.001，準(zhǔn)確性為±1%，重復(fù)性達(dá)0.5%。操作時室溫宜在15-30℃，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀A值時，要選取產(chǎn)物敏感吸收峰，如OPD用492nm波長。有酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀。各種酶標(biāo)儀性能有所不一樣，使用中應(yīng)詳細(xì)閱讀說明書。酶聯(lián)免疫法原理及操作第49頁6結(jié)果判斷

6.1定性測定定性測定結(jié)果判斷作出“有”或“無”回答，分別用“陽性”、“陰性”表示。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進(jìn)行試驗，呈陽性反應(yīng)