SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS）SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第1頁試驗(yàn)?zāi)繕?biāo)學(xué)習(xí)SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量原理掌握垂直板電泳操作方法。利用SDS測(cè)定蛋白質(zhì)分子量及染色判定。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第2頁試驗(yàn)流程配膠樣品制備電泳（1.5~2h）染色（20min）脫色（30min~2h）分析配分離膠(下膠)配濃縮膠(上膠)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第3頁實(shí)驗(yàn)過程1.裝配裝置BG-verMINI型迷你垂直電泳槽(北京百晶)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第4頁2.凝膠配制

實(shí)驗(yàn)過程*Acr有神經(jīng)毒性下膠(分離膠)10%上膠(濃縮膠)5%H2O3.9ml3.4ml30%Acr-Bis3.3ml0.83mlBuffer(含SDS)(1.5MTris-ClpH8.8)2.6ml(1MTris-ClpH6.8)0.68ml10%APS200ml100mlTEMED10ml10mlTOTAL10ml5mlSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第5頁實(shí)驗(yàn)過程3.灌膠※凝膠配制過程要快速,催化劑TEMED要在注膠前再加入,不然凝結(jié)無法注膠.注膠過程最好一次性完成,防止產(chǎn)生氣泡.1cm下膠高度，距齒下1cmAB

水封平齊，排氣泡加速聚合C棄水層凝固D灌上膠，插梳子梳需平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第6頁加入分離膠溶液pH8.8封水或飽和正丁醇溶液出現(xiàn)顯著界面時(shí)，分離膠凝聚完成（10~20min）倒出水或正丁醇，并用加樣槍/濾紙吸干制備分離膠(下膠)

封水目標(biāo)是使分離膠上表面平直，并排除氣泡。凝膠聚合好標(biāo)志是膠與水層之間形成清楚界面。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第7頁分離膠pH8.8加入濃縮膠溶液pH6.8制備濃縮膠(濃縮膠)樣梳需一次平穩(wěn)插入,梳口處不得有氣泡,梳底需水平。插入樣品梳SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第8頁1.SDS2.

-mercaptoethanol

3.bromophenolblue4.GlycerolSamplebuffer樣品處理ssSHSH金屬浴(100℃)中15minSamplebufferSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第9頁實(shí)驗(yàn)過程4.上樣、電泳A.樣品加熱，上樣B.電泳+（1）上膠恒壓80V(8V/cm)（2）下膠恒壓120V(12V/cm)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第10頁加入電極緩沖液pH8.3濃縮膠pH6.8通電分離膠pH8.8加入樣品上樣及電泳開始電壓恒定在80V，當(dāng)進(jìn)入分離膠后改為120V，溴酚藍(lán)距凝膠邊緣約5mm時(shí)，停頓電泳。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第11頁StakinggelSeparatinggelSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第12頁電流路徑

負(fù)極正極內(nèi)槽外槽凝膠外槽————SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第13頁實(shí)驗(yàn)過程5.染色、脫色染色20分鐘B.脫色30分鐘至2小時(shí)考馬斯亮蘭R250SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第14頁蛋白質(zhì)染色方法氨基黑

血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳考馬斯亮蘭R-250，G250

G250測(cè)定蛋白含量銀染

敏感度最高，常應(yīng)用于蛋白質(zhì)雙向電泳SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第15頁聚合原理()n()n()n()n()n+*Acr有神經(jīng)毒性n決定了交聯(lián)度與濃度一起決定孔徑大小過硫酸銨是催化劑TEMED是加速劑蛋白質(zhì)是29：1核酸是19：1SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第16頁實(shí)驗(yàn)原理1、帶電質(zhì)點(diǎn)在電場(chǎng)中向帶有異相電荷電極移動(dòng)，這種現(xiàn)象稱為電泳。電荷

分子大小分子形狀SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第17頁實(shí)驗(yàn)原理濃縮效應(yīng)Cl-Gly-Cl-Gly-Cl-Gly-PH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子Gly-Gly-Pr-Pr-Pr-PH8.8SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第18頁P(yáng)r為何帶負(fù)電加樣緩沖液二硫鍵鹽鍵疏水作用氫鍵巰基乙醇斷二硫鍵SDS斷化學(xué)鍵帶負(fù)電荷甘油SDS：Pr=1.4:1NC氨基酸側(cè)鏈SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-SO43-促沉溴酚蘭Tris?SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第19頁實(shí)驗(yàn)原理濃縮效應(yīng)Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子Pr-Pr-Pr-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.8快慢離子產(chǎn)生高電壓梯度Pr-運(yùn)動(dòng)加速SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第20頁實(shí)驗(yàn)原理濃縮效應(yīng)Cl-Cl-Cl-pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-pH8.85%10%快慢離子產(chǎn)生高電壓梯度Pr-運(yùn)動(dòng)加速濃縮效應(yīng)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第21頁SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第22頁實(shí)驗(yàn)原理分子篩效應(yīng)pH6.8Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加無快慢離子Pr-依據(jù)分子量運(yùn)動(dòng)分子篩效應(yīng)Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第23頁實(shí)驗(yàn)原理分子篩效應(yīng)pH6.8主要離子氯離子甘氨酸離子(pI5.97)蛋白質(zhì)離子pH8.85%10%甘氨酸解離增加無快慢離子Pr-依據(jù)分子量運(yùn)動(dòng)分子篩效應(yīng)Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第24頁實(shí)驗(yàn)原理分子篩效應(yīng)pH6.8pH8.85%10%lgMw電泳遷移率lgMw=-bx+KPrMw在11.7-165KdSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第25頁實(shí)驗(yàn)原理分子篩效應(yīng)pH6.8pH8.85%10%遷移率=蛋白質(zhì)移動(dòng)距離脫色后膠長(zhǎng)染色前膠長(zhǎng)指示劑移動(dòng)距離SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第26頁實(shí)驗(yàn)原理遷移率=“蛋白質(zhì)移動(dòng)距離”指示劑移動(dòng)距離染色前染色后蛋白質(zhì)帶在哪呢？L1L2L3L4LxL1XL3L2XL4SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第27頁P(yáng)ageRulerPrestainedProteinLadder

AprestainedSDSMWmarkerwithcontrastingcoloredreferencebandsat10and70kDa.SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第28頁注意事項(xiàng)采取此法測(cè)蛋白質(zhì)分子量時(shí)，必須完全打開二硫鍵。多亞基蛋白問題有些蛋白質(zhì)不能用SDS測(cè)定分子量。如電荷異?；驑?gòu)象異常蛋白質(zhì)，帶有較大輔基蛋白質(zhì)（一些糖蛋白）以及一些結(jié)構(gòu)蛋白，如膠原蛋白等。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第29頁思索題在不連續(xù)體系SDS中,當(dāng)分離膠加完后,需在其上加一層水,為何?電極緩沖液中甘氨酸作用?在不連續(xù)體系SDS中,分離膠與濃縮膠中均含有TEMED和AP,試述其作用?樣品液為何在加樣前需在沸水中加熱幾分鐘?SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第30頁976644292014MarkerSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第31頁Tanon-1600數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)GIS1D圖像分析軟件(Ver.4.00)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第32頁誘導(dǎo)前后蛋白表示差異IPTG誘導(dǎo)表示His-GFP融和蛋白（31.9kD）。1為誘導(dǎo)前，2～6分別為誘導(dǎo)0.5,1,1.5,2,2.5hrs。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第33頁電泳過程中不正?，F(xiàn)象1“微笑”現(xiàn)象指示劑前沿展現(xiàn)兩邊向上曲線形，主要是因?yàn)槟z中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚凝膠中。處理方法：待其充分凝固再作后續(xù)試驗(yàn)。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第34頁2皺眉現(xiàn)象

因?yàn)榇怪彪娪静垩b置不適當(dāng)引發(fā)，尤其是當(dāng)明膠和玻璃板組成“三明治底部有氣泡”或靠近隔片凝膠聚合不完全處理方法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第35頁3“拖尾”現(xiàn)象樣品溶解不佳引發(fā)或分離膠濃度過大

處理方法：加樣前離心選擇適當(dāng)樣品緩沖液和凝膠緩沖液加增溶試劑降低凝膠濃度SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第36頁4“紋理”現(xiàn)象樣品中不溶性顆粒引發(fā)處理方法：增加溶解度離心除去不溶性顆粒SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第37頁5偏斜現(xiàn)象電極放置不平行或加樣位置偏斜引發(fā)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第38頁6-2整塊膠分離條帶太寬

主要是未濃縮好原因處理方法：適當(dāng)增加濃縮膠長(zhǎng)度；確保濃縮膠貯液pH正確（6.7）；適當(dāng)降低電壓；6-1某一條泳道條帶太寬加樣量太多或者加樣孔泄露引發(fā)SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第39頁7.“鬼帶”

“鬼帶”就是在跑大分子、構(gòu)象復(fù)雜蛋白質(zhì)分子時(shí)，常會(huì)出現(xiàn)在泳道頂端（有時(shí)在濃縮膠中）一些大分子未知條帶或加樣孔底部有沉淀，主要因?yàn)檫€原劑在加熱過程中被氧化而失去活性，致使原來被解離蛋白質(zhì)分子重新折疊結(jié)合和亞基重新締合，聚合成大分子，其分子量要比目標(biāo)條帶大，有時(shí)不能進(jìn)入分離膠。但它卻與目標(biāo)條帶有相同免疫學(xué)活性，WB反應(yīng)中可見其能與目標(biāo)條帶對(duì)應(yīng)抗體作用。處理方法：在加熱煮沸后，再添加適量DTT或Beta巰基乙醇，以補(bǔ)充不足還原劑；或可加適量EDTA來阻止還原劑氧化。SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第40頁謝謝!SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第41頁附：蛋白質(zhì)提取與定量方法蛋白質(zhì)提取不一樣起源，不一樣方法SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第42頁提取原則細(xì)胞破碎適當(dāng)裂解液普通在冰上進(jìn)行加入適當(dāng)?shù)鞍酌敢种苿㏒DSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第43頁哺乳類細(xì)胞裂解液-RIPA50mMTris-HCl(pH7.4),150mMNaCl,1%NP-40（乙基苯基聚乙二醇，慣用非離子性去垢劑）,0.1%SDSSDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第44頁蛋白酶抑制劑抑制劑靶蛋白酶PMSF苯甲基磺酰氟絲氨酸蛋白酶EDTA金屬蛋白酶Leupeptin亮肽素絲氨酸和半胱氨酸蛋白酶Aprotinin抑肽酶胰蛋白酶及糜蛋白酶Pepstatin抑肽素天冬氨酸蛋白酶SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第45頁定量方法紫外吸收法BCA法Lowry法Bradford法SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第46頁以雙縮脲為基礎(chǔ)方法1.BCA法bicinchoninicacid二奎啉甲酸法SDSPAGE蛋白凝膠電泳專家講座第47頁以雙縮脲為基礎(chǔ)方法2.lowry法

folin酚法磷鎢酸和磷鉬酸鎢藍(lán)、鉬藍(lán)BCA和Lowry法比雙縮脲靈敏高100倍

0.005-0.10mg/ml

SDSPAGE蛋