酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第1頁(yè)免疫標(biāo)識(shí)技術(shù)定義：

將抗原-抗體反應(yīng)與標(biāo)識(shí)技術(shù)相結(jié)合，用放射性同位素、酶或熒光素標(biāo)識(shí)已知抗體或抗原，經(jīng)過(guò)檢測(cè)標(biāo)識(shí)物，間接測(cè)定未知抗原或抗體。分類：放射免疫測(cè)定法：131I，32P免疫熒光技術(shù)：FITC，PE免疫酶測(cè)定法：HRP，AP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第2頁(yè)免疫酶測(cè)定法

(EnzymeImmunoAssay,EIA)用酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。

辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，堿性磷酸酶(AP)特點(diǎn)：高度特異性：保持抗原抗體反應(yīng)特異性高靈敏度：酶催化底物顯色高效性，pg水平微量檢測(cè)定性定量檢測(cè)：反應(yīng)液顏色深淺或光密度值分類：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)：可溶性抗原或抗體酶免疫組化法：組織中或細(xì)胞表面抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第3頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)用酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體檢測(cè)液體（血液、細(xì)胞液）中未知抗體或抗原方法。1.定義2.原理（1）利用抗原與抗體特異反應(yīng)將待測(cè)物與酶連接。（2）經(jīng)過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定。測(cè)定對(duì)象能夠是抗體也能夠是抗原。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第4頁(yè)3.常見(jiàn)種類直接法（directELISA）：將已知抗原直接吸附于載體，加酶標(biāo)抗體檢測(cè)抗體間接法（IndirectELISA）：將已知抗原吸附于固相載體，加酶標(biāo)識(shí)二抗檢測(cè)液相中未知抗體雙抗體夾心法（SandwichELISA)：將已知抗體吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)一抗檢測(cè)液相中可溶性抗原競(jìng)爭(zhēng)法（CompetitiveELISA)：將已知抗體或抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)抗原或抗體檢測(cè)液相中可溶性抗原或抗體阻斷法（BlockELISA)：將已知抗原吸附于固相載體，酶標(biāo)識(shí)單克隆抗體檢測(cè)液相中可溶性抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第5頁(yè)（1）

直接法測(cè)定抗原A.

將抗原吸附在載體表面；B.

加酶標(biāo)抗體，形成抗原—抗體復(fù)合物；C.加底物。底物降解量＝抗原量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第6頁(yè)（2）間接法測(cè)定抗體A.

將抗原吸附于固相載體表面；B.

加抗體,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體；D.加底物。測(cè)定底物降解量＝抗體量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第7頁(yè)（3）雙抗體夾心法測(cè)定抗原A.

將抗體吸附于固相表面;B.

加待檢抗原，形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

加酶標(biāo)抗體;E.加底物。底物降解量＝抗原量。

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第8頁(yè)

（4）競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原A.

將抗體吸附在固相載體表面;B.同時(shí)加入酶標(biāo)抗原和待測(cè)抗原，競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合抗體；對(duì)照只加入酶標(biāo)抗原；C.加底物。對(duì)照孔與樣品孔底物降解量差＝未知抗原量。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第9頁(yè)

（5）阻斷法測(cè)定抗體本法主要用于檢測(cè)型特異性抗體。該方法現(xiàn)已成為豬傳染性胃腸炎（TGE）、豬偽狂犬?。≒R）及豬胸膜肺炎（AP）主要檢測(cè)方法。A.

將抗原吸附在固相載體表面;B.先加待檢血清（抗體）,形成抗原-抗體復(fù)合物;C.

再加酶標(biāo)單抗；D.加底物。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第10頁(yè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay,ELISA)4.原理（以ELISA為例）：顯色酶標(biāo)單抗酶標(biāo)單抗酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第11頁(yè)試驗(yàn)材料豬偽狂犬病毒（PRV）

——

抗原陰性對(duì)照陽(yáng)性對(duì)照樣品

——

待測(cè)豬血清HRP標(biāo)識(shí)豬PRV單抗——

酶標(biāo)單抗包被緩沖液：0.025MpH9.6碳酸鹽緩沖液洗滌液：含0.05%Tween200.01MpH7.4PBS底物緩沖液：pH5.0磷酸鹽檸檬酸緩沖液底物溶液：TMB（四甲基聯(lián)苯胺），底物緩沖液，30%H2O2，新鮮配制酶標(biāo)板，酶標(biāo)儀阻斷法測(cè)定豬偽狂犬病病毒ELISA抗體——定性檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第12頁(yè)試驗(yàn)方法1.抗原處理：2.包被抗原：取酶標(biāo)板，加入100μL/孔抗原稀釋液4℃，濕盒內(nèi)，18h酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第13頁(yè)取出包被好抗原酶標(biāo)板（4孔/組），甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次3.加待測(cè)血清標(biāo)識(shí)各孔，加入對(duì)應(yīng)液體100μL/孔1234陰性空白陽(yáng)性待測(cè)4.加單抗：37℃，濕盒內(nèi)，30min甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次各孔加入酶標(biāo)單抗100μL/孔37℃，濕盒內(nèi)，30min5.顯色：甩干孔內(nèi)液體以洗滌液（200μL/孔）洗滌3次，3min/次加入底物溶液100μL/孔避光顯色，10min6.觀察結(jié)果試驗(yàn)方法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第14頁(yè)1、取已包被豬偽狂犬病毒抗原酶標(biāo)板（依據(jù)樣品多少，可拆開(kāi)分次使用），用樣品稀釋液（PBS）將待檢血清1∶1稀釋后加入板孔中，每孔加100μl。一樣1∶1稀釋陰、陽(yáng)性對(duì)照血清，陰、陽(yáng)性對(duì)照各設(shè)1孔，每孔100μl。另設(shè)一空白對(duì)照孔，空白對(duì)照孔加100μl稀釋液。輕輕振勻孔中樣品（勿溢出），置37℃溫育30分鐘。2、洗板：甩掉板孔中溶液，每孔加入稀釋好洗滌液200μl，靜置3分鐘倒掉，再在吸水紙上拍干，重復(fù)3次。3、每孔加酶標(biāo)單抗100μl，置37℃溫育30分鐘。4、洗板：洗滌3次（方法同時(shí)驟2）。切記每次在干吸水紙上拍干。5、顯色與終止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50μl)，混勻。室溫（18-25℃）避光顯色10分鐘后。6、終止：每孔加終止液1滴(50μl)（0.25%氫氟酸），終止反應(yīng)。7、10分鐘內(nèi)測(cè)定結(jié)果。采取波長(zhǎng)630nm酶標(biāo)儀測(cè)定OD值。檢測(cè)樣本OD值≥0.35為陽(yáng)性8、結(jié)果判定：試驗(yàn)成立條件是：陰性對(duì)照孔平均OD630值與陽(yáng)性對(duì)照孔平均OD630值之差≥0.4。S=樣品孔OD630值，N=陰性對(duì)照孔OD630值假如S/N比值≤0.6，樣品判定為PRV抗體陽(yáng)性。假如S/N比值≤0.7但>0.6，樣品重測(cè)。假如S/N比值>0.7，樣品判定為PRV抗體陰性詳細(xì)操作步驟酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第15頁(yè)預(yù)期結(jié)果陰性：顯色為藍(lán)色陽(yáng)性：無(wú)色1234陽(yáng)性陽(yáng)性陰性陰性常見(jiàn)酶及底物常見(jiàn)酶底物加終止液前顏色加終止液后顏色辣根過(guò)氧化物酶（HRP）堿性磷酸酶（AP）鄰苯二胺（OPD）四甲基聯(lián)苯胺（TMB）對(duì)硝基苯磷酸酯（p-NPP）橙黃色藍(lán)色棕黃色藍(lán)色黃色酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)elisa第16頁(yè)注意事項(xiàng)1、ELISA試驗(yàn)前血清樣品盡可能做到37℃滅活30