土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座

準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（作為對(duì)照組）和選擇培養(yǎng)基。將菌液稀釋相同倍數(shù)（見(jiàn)教材23頁(yè)“樣品稀釋流程示意圖”）。稀釋倍數(shù)為103～107。每個(gè)稀釋度均用3個(gè)選擇培養(yǎng)基，1個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，共需要15個(gè)選擇培養(yǎng)基，5個(gè)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（都作好標(biāo)識(shí)）。（2）制備培養(yǎng)基

（3）高溫消毒

將準(zhǔn)備好培養(yǎng)基和8支試管、一支移液管（用紙包好）放到高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)進(jìn)行滅菌處理。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第1頁(yè)

將10g土樣加入盛有90mL無(wú)菌生理鹽水錐形瓶中（錐形瓶體積為250mL），充分搖勻，吸收上清液1mL，轉(zhuǎn)移至盛有9mL生理鹽水無(wú)菌大試管中，依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107～103稀釋度次序分別吸收0.1mL進(jìn)行平板涂布操作。按照濃度從低到高次序涂布平板。（4）微生物培養(yǎng)與觀察

將涂布好培養(yǎng)皿放在30℃溫度下培養(yǎng)。伴隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，會(huì)有不一樣菌落產(chǎn)生。比較牛肉膏培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基中菌落數(shù)量、形態(tài)等，并做好統(tǒng)計(jì)。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第2頁(yè)

挑選選擇培養(yǎng)基中不一樣形態(tài)菌落接入含酚紅培養(yǎng)基斜面中，觀察能否產(chǎn)生如書(shū)本中圖2-10顏色反應(yīng)。（5）細(xì)菌計(jì)數(shù)

選取菌落數(shù)在30～300平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。在同一稀釋度下，最少對(duì)3個(gè)平板進(jìn)行重復(fù)計(jì)數(shù)，然后求出平均值，并依據(jù)平板所對(duì)應(yīng)稀釋度計(jì)算出樣品中細(xì)菌數(shù)目。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第3頁(yè)二、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)

1.培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對(duì)照培養(yǎng)皿在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)，說(shuō)明培養(yǎng)基沒(méi)有被雜菌污染。牛肉膏培養(yǎng)基菌落數(shù)目顯著大于選擇培養(yǎng)基數(shù)目，說(shuō)明選擇培養(yǎng)基已篩選出一些菌落。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第4頁(yè)2.樣品稀釋操作是否成功假如得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30～300平板，則說(shuō)明稀釋操作比較成功，并能夠進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。3.重復(fù)組結(jié)果是否一致假如各位同學(xué)選取是同一個(gè)土樣，統(tǒng)計(jì)結(jié)果應(yīng)該靠近。假如結(jié)果相差太遠(yuǎn)，則需要從各項(xiàng)操作過(guò)程中去分析、尋找可能原因。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第5頁(yè)三、課題延伸

能分解尿素細(xì)菌判定判定原理：細(xì)菌合成脲酶將尿素分解成氨，會(huì)使培養(yǎng)基pH升高。判定方法：在以尿素為唯一氮源培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，利用此培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色改變。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第6頁(yè)分解纖維素微生物分離（一）纖維素與纖維素酶纖維素：一個(gè)由葡萄糖首尾相連而成高分子化合物，廣泛地存在于植物根、莖、葉等器官中。纖維素酶：由微生物分泌一個(gè)復(fù)合酶，包含C1酶、Cx酶和葡萄糖苷酶，因?yàn)樗鼈儏f(xié)同作用，最終將纖維素分解成葡萄糖。纖維素C1酶Cx酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第7頁(yè)①取二支20mL試管試驗(yàn)：纖維素酶分解纖維素試驗(yàn)②各加入一張濾紙條③各加入10mL0.1mol/L醋酸－醋酸鈉緩沖液甲乙④在甲試管中加入1mL蒸餾水，乙試管加入1mL纖維素酶⑤將試管放在140r/min搖床上振蕩1h⑥結(jié)果：乙試管濾紙條消失討論：乙試管濾紙條為何會(huì)消失？甲試管作用是什么？土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第8頁(yè)剛果紅染色法剛果紅能與纖維素形成紅色復(fù)合物，而不與水解后纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。（二）纖維素分解菌篩選用加入剛果紅纖維素培養(yǎng)基去培養(yǎng)微生物時(shí)，假如培養(yǎng)基中出現(xiàn)以菌落為中心透明圈時(shí)，可說(shuō)明該菌落是纖維素分解菌，因?yàn)樗褜⒈粍偣t染成紅色纖維素分解了。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第9頁(yè)一、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)請(qǐng)你依據(jù)試驗(yàn)流程圖和提供三個(gè)資料以及“操作提醒”，在思索相關(guān)問(wèn)題基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)出一個(gè)詳細(xì)試驗(yàn)方案。土壤取樣選擇培養(yǎng)梯度稀釋將樣品涂布在判別纖維素分解菌培養(yǎng)基上篩選產(chǎn)生透明圈菌落土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第10頁(yè)土壤中纖維素分解菌分離

1.土樣采集

：土樣采集方法與本專(zhuān)題課題2類(lèi)似。土樣采集要選擇富含纖維素環(huán)境，這是因?yàn)樵诶w維素含量豐富環(huán)境，通常會(huì)聚集較多分解纖維素微生物。假如找不到適當(dāng)環(huán)境，能夠?qū)V紙埋在土壤中，過(guò)一個(gè)月左右也會(huì)有能分解纖維素微生物生長(zhǎng)。二、實(shí)驗(yàn)案例土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第11頁(yè)2.選擇培養(yǎng)

：選擇培養(yǎng)需要儀器有：250mL錐形瓶、無(wú)菌稱(chēng)量瓶、藥匙、1mL和10mL移液管、天平、搖床、溫度計(jì)等。在250mL錐形瓶中裝入30mL選擇培養(yǎng)基，用8層紗布做成瓶塞，將瓶口塞緊，再在瓶塞外包裹兩層包裝紙，用線(xiàn)繩扎緊，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。選擇培養(yǎng)操作：稱(chēng)取土樣20g，在無(wú)菌條件下加入裝有30mL培養(yǎng)基搖瓶中。將搖瓶置于搖床上，在30℃下振蕩培養(yǎng)1～2d，至培養(yǎng)基變混濁，重復(fù)上述方法再培養(yǎng)一次，然后再進(jìn)行梯度稀釋和涂布平板。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第12頁(yè)3.剛果紅染色法分離：纖維素分解菌這一步所需要儀器有：無(wú)菌培養(yǎng)皿、涂布器、1mL移液管，裝有9mL無(wú)菌水20mL大試管，溫箱等。培養(yǎng)基制備參考書(shū)本旁欄中百分比配制。在500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，在121℃下高壓蒸汽滅菌20min。倒平板操作：將滅菌后固體培養(yǎng)基熔化，按無(wú)菌操作要求，在無(wú)菌培養(yǎng)皿中倒入15～20mL培養(yǎng)基，凝固后待用。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第13頁(yè)

涂布平板：將稀釋度為104～106菌懸液各取0.1mL，滴加在平板培養(yǎng)基上，用涂布器將菌液涂布均勻，在30℃倒置培養(yǎng)，至菌落長(zhǎng)出。每個(gè)稀釋度下需涂布3個(gè)平板，并注意設(shè)置對(duì)照。剛果紅染色詳細(xì)操作步驟參考書(shū)本［資料三］。

制備菌懸液：按照本專(zhuān)題課題1稀釋操作方法，將選擇培養(yǎng)后培養(yǎng)基進(jìn)行等比稀釋?zhuān)♂屪畲蟊稊?shù)至106。土壤微生物的分離和計(jì)數(shù)專(zhuān)家講座第14頁(yè)三、結(jié)果分析與評(píng)價(jià)1.培養(yǎng)基制作是否合格以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出菌落對(duì)照培養(yǎng)基在培養(yǎng)過(guò)程中沒(méi)有菌落生長(zhǎng)則說(shuō)明培養(yǎng)基制作合格。假如觀察到