微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座

顯微鏡放大法——細菌形體微小，肉眼不能直接看到，必須借助顯微鏡（普通光學(xué)顯微鏡、電子顯微鏡）放大后才能觀察。染色檢驗法——細菌體小,半透明，經(jīng)染色后才能觀察較清楚。微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第1頁普通光學(xué)顯微鏡分辨率為0.25um。普通細菌都大于0.25um，故可用普通光學(xué)顯微鏡觀察。１、普通光學(xué)顯微鏡(lightmicroscope)一、顯微鏡放大法微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第2頁電子顯微鏡分辨率為1nm。不但能看清細菌外形，內(nèi)部超微結(jié)構(gòu)可一覽無余。２、電子顯微鏡(electronmicroscope)肺炎鏈球菌莢膜莢膜一、顯微鏡放大法微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第3頁3、透射電鏡4、掃描電鏡微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第4頁二、染色檢驗法因為細菌細胞微小又透明，普通先要經(jīng)過染色才能作顯微觀察革蘭氏染色法細菌染色判別染色法簡單染色法負染色：正染色死菌活菌抗酸性染色法芽孢染色法姬姆薩染色法莢膜染色法用美藍或TTC等作活菌染色微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第5頁（一）單染色法1、原理細菌體積小，五色半透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易觀察清楚，通常需染色來增加菌體與背景之間色差，這比不染色標(biāo)本清楚易辨。因為細菌等電點為pH2～5，在靠近中性環(huán)境中通常帶負電荷，易與帶正電荷堿性染料相結(jié)合而染上顏色，故慣用亞甲藍、堿性復(fù)紅、草酸銨結(jié)晶紫等染料染色。單染法只使用一個染料，所染細菌均被染成一個顏色，普通能夠顯示細菌形態(tài)、排列和大小，但不能顯示細菌內(nèi)部結(jié)構(gòu)。微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第6頁２、慣用染料和器具

大腸桿菌和金黃色葡萄球菌18～24h培養(yǎng)物，生理鹽水，亞甲藍染色液，堿性復(fù)紅染液，香柏油，二甲苯，顯微鏡，接種環(huán)，吸水紙，載玻片，酒精燈，擦鏡紙。微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第7頁３、方法（1）涂片取潔凈載玻片一塊，滴一小滴生理鹽水于載玻片中央(如被檢材料是液體，可不加生理鹽水)。將接種環(huán)在酒精燈火焰上滅菌，冷卻后，伸人被檢菌試管取菌少許(切不可多，更不可將培養(yǎng)基刮下)，混入載玻片上生理鹽水中，磨勻并涂抹成直徑1．5cm左右均勻薄層菌膜。將接種環(huán)滅菌后放回原處。（2）干燥涂片最好在室溫中讓其自然干燥。有時為了干燥得快些也可在酒精燈火焰上方烘干，但勿緊靠火焰；也能夠用吹風(fēng)機吹干。

微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第8頁３、方法（3）固定讓菌膜面朝上，將載玻片在酒精燈火焰外層往返經(jīng)過3次，此為“固定”。目標(biāo)是使細胞質(zhì)凝固，以固定細菌形態(tài)，并使細菌粘附于玻片上，染色和水沖時不會脫落。（4）染色將細菌涂片平置，滴加1滴亞甲藍(或復(fù)紅染液)于菌膜上，染液以覆蓋涂抹標(biāo)本為度，染色1—2min。（5）水洗斜置載玻片，用細水流從上端流下洗去多出染液。（6）干燥自然干燥或用吹風(fēng)機吹干水分。（7）鏡檢先用低倍鏡找到物像，并將物像調(diào)到視野中央，再于標(biāo)本上滴上一滴香柏油，置于油鏡下進行觀察。

微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第9頁４、注意事項（1）固定時溫度不可過高，以載玻片反面觸及皮膚時熱而不燙為宜。（2）水洗時，不要對著標(biāo)本直接沖洗，以免沖去被檢標(biāo)本，普通以沖洗下來水基本無色為度。（3）染色完成，傾去水分，于室溫中自然干燥，不可在標(biāo)本上擦試，以免擦損標(biāo)本。

微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第10頁微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第11頁（二）革蘭染色法：

C.Gram（革蘭）于1884年創(chuàng)造一個判別不一樣類型細菌染色方法。二、染色檢驗法微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第12頁（二）革蘭染色法１、染色步驟（1）初染（結(jié)晶紫30S）（2）媒染劑（碘液30S）（3）脫色（95%乙醇10~20S）（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）

微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第13頁

ABBBABAA（1）初染（結(jié)晶紫30S）革蘭氏染色程序和結(jié)果（1）初染（結(jié)晶紫30S）（2）媒染劑（碘液30S）（3）脫色（95%乙醇10~20S）（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第14頁ABBBABAA革蘭氏染色程序和結(jié)果（2）媒染劑（碘液30S）（1）初染（結(jié)晶紫30S）（2）媒染劑（碘液30S）

（3）脫色（95%乙醇10~20S）（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第15頁ABBBABAA革蘭氏染色程序和結(jié)果（3）脫色（95%乙醇10~20S）（1）初染（結(jié)晶紫30S）（2）媒染劑（碘液30S）（3）脫色（95%乙醇10-20S）（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第16頁ABBBABAA革蘭氏染色程序和結(jié)果（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）A：革蘭氏陽性細菌G+B：革蘭氏陰性細菌G﹣為何？（1）初染（結(jié)晶紫30S）（2）媒染劑（碘液30S）（3）脫色（95%乙醇10~20S）（4）復(fù)染（蕃紅30~60S）微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第17頁２、染色原理第一步：結(jié)晶紫使菌體著上紫色第二步：碘和結(jié)晶紫形成大分子復(fù)合物，分子大，能被細胞壁阻留在細胞內(nèi)。第三步：酒精脫色，細胞壁成份和結(jié)構(gòu)不一樣，出現(xiàn)不一樣反應(yīng)。G+菌：細胞壁厚，肽聚糖含量高，交聯(lián)度大，當(dāng)乙醇脫色時，肽聚糖因脫水而孔徑縮小，故結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被阻留在細胞內(nèi)，細胞不能被酒精脫色，仍呈紫色。Gˉ菌：肽聚糖層薄，交聯(lián)渙散，乙醇脫色不能使其結(jié)構(gòu)收縮，因其含脂量高,乙醇將脂溶解，縫隙加大，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物溶出細胞壁，酒精將細胞脫色，細胞無色，沙黃復(fù)染后呈紅色。微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第18頁３、結(jié)果判斷菌體呈紫色為革蘭氏陽性菌（G+）菌體呈紅色為革蘭氏陰性菌（G-）微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第19頁陽性菌陰性菌革蘭陽性

革蘭陰性微生物學(xué)醫(yī)學(xué)知識講座第20頁４、注意事項

（1）載玻片要潔凈無油。（2）涂片以勻薄為佳，切不可濃厚。過于密集菌體，因洗脫不勻常呈假陽性。（3）要嚴格控制各試劑作用時