單線態(tài)和三線態(tài)

光譜分析原子光譜原子吸收原子發(fā)射原子熒光分子光譜分子吸收紫外-可見(jiàn)光譜分子發(fā)光1單線態(tài)和三線態(tài)第二章分子發(fā)光分析分子吸收能量激發(fā)為激發(fā)態(tài)釋放出能量基態(tài)電能化學(xué)能光能稱為“發(fā)光”光的形式釋放熒光磷光分子發(fā)光光致發(fā)光化學(xué)發(fā)光輻射躍遷非輻射躍遷以熱的形式釋放2單線態(tài)和三線態(tài)

分子熒光分析法一、基本原理（一）熒光和磷光的產(chǎn)生

從分子結(jié)構(gòu)理論來(lái)討論分子中電子的能量狀態(tài)電子所處的能級(jí)振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)動(dòng)能級(jí)電子的多重態(tài)J=2S+1S：為各電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和S=0,J=1單重態(tài)S表示（所有電子都是自旋配對(duì)的）S=1,J=3三重態(tài)T表示大多數(shù)基態(tài)分子都處于單重態(tài)電子在躍遷過(guò)程中伴隨著自旋方向的變化（自旋平行）3單線態(tài)和三線態(tài)基態(tài)單重態(tài)S激發(fā)態(tài)單重態(tài)S激發(fā)態(tài)三重態(tài)T激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點(diǎn)：⑴S是抗磁分子，T是順磁分子⑵tS=10-8s,tT=10-4～1s；(發(fā)光速度很慢)⑶基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷；⑷激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低4單線態(tài)和三線態(tài)其中S0、S1和S2分別表示分子的基態(tài)、第一和第二電子激發(fā)的單重態(tài)T1和T2則分別表示分子的第一和第二電子激發(fā)的三重態(tài)。V=0、1、2、3、…表示基態(tài)和激發(fā)態(tài)的振動(dòng)能級(jí)。

2．分子內(nèi)的光物理過(guò)程5單線態(tài)和三線態(tài)S0S1S2T1吸光

1吸光

2振動(dòng)弛豫:在同一電子能級(jí)中，電子由高振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)至低振動(dòng)能級(jí)，而將多余的能量以熱的形式發(fā)出。發(fā)生振動(dòng)弛豫的時(shí)間為10-12s數(shù)量級(jí)。非輻射能量傳遞過(guò)程；6單線態(tài)和三線態(tài)S0S1S2T1吸光

1吸光

2內(nèi)轉(zhuǎn)移:

當(dāng)兩個(gè)電子能級(jí)非常靠近以至其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，常發(fā)生電子由高能級(jí)以無(wú)輻射躍遷方式轉(zhuǎn)移至低能級(jí)。（S1轉(zhuǎn)移S2）7單線態(tài)和三線態(tài)S0S1S2T1吸光

1吸光

2熒光

3系間竄躍:指不同多重態(tài)間的無(wú)輻射躍遷，例如S1→T1就是一種系間竄躍。通常，發(fā)生系間竄躍時(shí)，電子由S1的較低振動(dòng)能級(jí)轉(zhuǎn)移至T1的較高振動(dòng)能級(jí)處。8單線態(tài)和三線態(tài)輻射能量傳遞過(guò)程熒光發(fā)射:電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)→基態(tài)

S0S1S2T1吸光

1吸光

2熒光

3熒光得到最大波長(zhǎng)為λ3的熒光由圖可見(jiàn)，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小

λ3>λ2

>λ19單線態(tài)和三線態(tài)磷光發(fā)射:

電子由基態(tài)單重態(tài)激發(fā)至第一激發(fā)三重態(tài)的幾率很小，因?yàn)檫@是禁阻躍遷。但是，由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)，有可能以系間竄躍方式轉(zhuǎn)至第一激發(fā)三重態(tài)，再經(jīng)過(guò)振動(dòng)馳豫，轉(zhuǎn)至其最低振動(dòng)能級(jí)，由此激發(fā)態(tài)躍回至基態(tài)時(shí)，便發(fā)射磷光，這個(gè)躍遷過(guò)程（T1→S0）也是自旋禁阻的，其發(fā)光速率較慢，約為10-4-10s。因此，這種躍遷所發(fā)射的光，在光照停止后，仍可持續(xù)一段時(shí)間。S0S1S2T1吸光

1吸光

2熒光

3磷光磷光10單線態(tài)和三線態(tài)外轉(zhuǎn)移

指激發(fā)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子的相互作用及能量轉(zhuǎn)移，使熒光或磷光強(qiáng)度減弱甚至消失。這一現(xiàn)象稱為“熄滅”或“猝滅”。熒光與磷光的根本區(qū)別：

磷光是由激發(fā)三重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)熒光是由激發(fā)單重態(tài)最低振動(dòng)能層至基態(tài)區(qū)別11單線態(tài)和三線態(tài)(二)熒光的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜

激發(fā)光譜:(ex)以不同波長(zhǎng)的入射光激發(fā)熒光物質(zhì),在熒光最強(qiáng)的波長(zhǎng)處測(cè)量熒光強(qiáng)度即以激發(fā)光波長(zhǎng)為橫坐標(biāo),以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)繪制曲線即可得到激發(fā)光譜曲線。發(fā)射光譜：(em)固定激發(fā)光波長(zhǎng)（最大）然后測(cè)定不同的波長(zhǎng)時(shí)所發(fā)射的熒光強(qiáng)度即可繪制熒光發(fā)射光譜曲線12單線態(tài)和三線態(tài)在熒光的產(chǎn)生過(guò)程中，由于存在各種形式的無(wú)輻射躍遷，損失能量，所以它們的最大發(fā)射波長(zhǎng)都向長(zhǎng)波方向移動(dòng)，以磷光波長(zhǎng)的移動(dòng)最多，而且它的強(qiáng)度也相對(duì)較弱。13單線態(tài)和三線態(tài)14單線態(tài)和三線態(tài)激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關(guān)系a.Stokes位移

激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長(zhǎng)差值。發(fā)射光譜的波長(zhǎng)比激發(fā)光譜的長(zhǎng)，振動(dòng)弛豫消耗了能量。b.發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)

電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級(jí)，吸收不同波長(zhǎng)的能量(如能級(jí)圖

2,

1)，產(chǎn)生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)再躍遷回到基態(tài)，產(chǎn)生波長(zhǎng)一定的熒光c.鏡像規(guī)則

通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對(duì)稱關(guān)系。15單線態(tài)和三線態(tài)（三）熒光的影響因素分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：①分子必須具有與所照射的輻射頻率(紫外-可見(jiàn)光）相適應(yīng)的結(jié)構(gòu)（共軛雙鍵），才能吸收激發(fā)光；②吸收了與其本身特征頻率相同的能量之后，必須具有一定的熒光量子產(chǎn)率。16單線態(tài)和三線態(tài)1.熒光效率它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通常用下式表示

熒光效率越高；物質(zhì)發(fā)射熒光越強(qiáng)kf為熒光發(fā)射過(guò)程的速率常數(shù)（與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)）

ki為其它有關(guān)過(guò)程的速率常數(shù)的總和（化學(xué)環(huán)境）凡使kf

值升高而使ki值降低的因素，都可增強(qiáng)熒光。17單線態(tài)和三線態(tài)2.熒光與有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的關(guān)系（1）躍遷類型實(shí)驗(yàn)證明，對(duì)于大多數(shù)熒光物質(zhì)，首先經(jīng)歷

激發(fā)，然后經(jīng)過(guò)振動(dòng)弛豫或其他無(wú)輻射躍遷，再發(fā)生

躍遷而得到熒光。（2）共軛效應(yīng)實(shí)驗(yàn)證明，容易實(shí)現(xiàn)

激發(fā)的芳香族化合物容易發(fā)生熒光，增加體系的共軛度熒光效率一般也將增大，主要是由于增大熒光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)，有利于產(chǎn)生更多的激發(fā)態(tài)分子18單線態(tài)和三線態(tài)(3)剛性平面結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光。因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子的振動(dòng)，使分子與溶劑或其它溶質(zhì)分子的相互作用減少，也就減少了碰撞去活的可能性。19單線態(tài)和三線態(tài)（4）取代基效應(yīng)芳環(huán)上取代基給電子基團(tuán)，熒光增強(qiáng)（-OH、-OR、-CN、-NH2）產(chǎn)生了p-共軛作用，增強(qiáng)了電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾率增大。吸電子基團(tuán)減弱甚至?xí)鐭晒馊?COOH、-NO、-C

O、鹵素鹵素取代基隨原子序數(shù)的增加而熒光降低在重原子中，能級(jí)之間的交叉現(xiàn)象比較嚴(yán)重，因此容易發(fā)生自旋軌道的相互作用，增加了由單重態(tài)轉(zhuǎn)化為三重態(tài)的速率20單線態(tài)和三線態(tài)3.金屬螯合物的熒光大多數(shù)無(wú)機(jī)鹽類金屬離子，在溶液中只能發(fā)生無(wú)輻射躍遷，因而不產(chǎn)生熒光。不少有機(jī)化合物雖然具有共軛雙鍵，但由于不是剛性結(jié)構(gòu)，分子處于非同一平面，因而不發(fā)生熒光。但是，若這些化合物和金屬離子形成螯合物，隨著分子的剛性增強(qiáng)，平面結(jié)構(gòu)的增大，常會(huì)發(fā)生熒光21單線態(tài)和三線態(tài)22單線態(tài)和三線態(tài)

同一種熒光物質(zhì)溶于不同溶劑，其熒光光譜的位置和強(qiáng)度可能有明顯不同。4．溶劑效應(yīng)一般情況下，隨著溶劑的極性的增加，熒光物質(zhì)的π→π*

躍遷幾率增加，熒光強(qiáng)度將增強(qiáng)，熒光波長(zhǎng)也發(fā)生紅移。5．溫度的影響一般說(shuō)來(lái)，大多數(shù)熒光物質(zhì)的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強(qiáng)度將增加如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時(shí)，熒光效率為100%。23單線態(tài)和三線態(tài)（四）溶液的熒光（或磷光）強(qiáng)度1.熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系

熒光強(qiáng)度If正比于吸收的光量Ia與熒光量子產(chǎn)率

。

If=

Ia式中

為熒光量子效率，又根據(jù)Beer定律A=-lgI/I0I=I0.10-A

Ia=I0-I=I0(1-10-A)I0和I分別是入射光強(qiáng)度和透射光強(qiáng)度。代入上式得

If=

I0(1-10-kbc)24單線態(tài)和三線態(tài)整理得：

If=2.3

I0

kbc當(dāng)入射光強(qiáng)度I0和b一定時(shí)，上式為：

If=Kc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成之正比，但這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng)kbc0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃溶液，由于猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光強(qiáng)度和濃度不呈線性關(guān)系。

25單線態(tài)和三線態(tài)2、影響熒光強(qiáng)度的環(huán)境因素因素溶劑一般溶劑效應(yīng)折射率和介電常數(shù)的影響特殊溶劑效應(yīng)熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用如氫鍵的生成同一種熒光物質(zhì)在不同的溶劑中的熒光光譜不同溫度溫度上升使熒光強(qiáng)度下降內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用增大碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的幾率增加酸度化合物所處狀態(tài)不同電子構(gòu)型上有所不同熒光強(qiáng)度和熒光光譜不同26單線態(tài)和三線態(tài)27單線態(tài)和三線態(tài)3、熒光猝滅定義：熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或其它溶質(zhì)分子

的相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象類型碰撞猝滅激發(fā)單重態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子相碰撞熒光分子以無(wú)輻射躍遷的方式回到基態(tài)靜態(tài)猝滅熒光物質(zhì)分子與猝滅劑分子生成非熒光的絡(luò)合物轉(zhuǎn)入三重態(tài)的猝滅發(fā)生電子轉(zhuǎn)移反應(yīng)的猝滅猝滅劑與熒光物質(zhì)熒光物質(zhì)的自猝滅濃度較高單重激發(fā)態(tài)的分子在發(fā)生熒光之前和未激發(fā)的熒光物質(zhì)分子碰撞而引起的自猝滅溶解氧與熒光物質(zhì)28單線態(tài)和三線態(tài)光源氙燈和高壓汞燈激發(fā)單色器光柵掃描激發(fā)光譜，選擇激發(fā)波長(zhǎng)樣品池I0

IIf發(fā)射單色器掃描發(fā)射光譜消除其它光線的干擾獲得所需的熒光檢測(cè)器顯示器與分光光度計(jì)的差別兩個(gè)單色器兩個(gè)單色器互成直角光電倍增管二、熒光分析儀29單線態(tài)和三線態(tài)三、分子熒光分析法及其應(yīng)用1.熒光分析方法的特點(diǎn)（1）靈敏度高（2）選擇性強(qiáng)（3）試樣量少和方法簡(jiǎn)單（4）提供比較多的物理參數(shù)2、熒光定量分析的方法方法標(biāo)準(zhǔn)曲線法熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)濃度成正比的關(guān)系比較法同樣條件下，測(cè)定試樣溶液和一標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，直接通過(guò)比例計(jì)算30單線態(tài)和三線態(tài)3、熒光分析法的應(yīng)用方法直接熒光法被測(cè)物本身有熒光被測(cè)物與試劑反應(yīng)后F與物質(zhì)的濃度成正比熒光猝滅法被測(cè)物使熒光熄滅由熒光強(qiáng)度降低的強(qiáng)度來(lái)測(cè)定被測(cè)物的含量

間接熒光法某些陰離子奪取金屬絡(luò)合物中金屬離子，而釋放出能發(fā)熒光的配位體催化熒光法反應(yīng)速度慢，熒光微弱，難測(cè)定金屬離子將加速反應(yīng)進(jìn)行31單線態(tài)和三線態(tài)磷光分析法

1．如何獲得較強(qiáng)的磷光增加試樣的剛性: 低溫冷凍固體磷光法： 吸附于固相載體（濾紙）分子締合物的形成： 加入表面活性劑等重原子效應(yīng)： 加入含重原子的物質(zhì)，如銀鹽等敏化磷光： 通過(guò)能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生磷光

磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)

→基態(tài)，T1→S0躍遷；

電子由S0進(jìn)入T1的可能過(guò)程：（S0→T1禁阻躍遷）32單線態(tài)和三線態(tài)

熒光計(jì)上配上磷光測(cè)量附件即可對(duì)磷光進(jìn)行測(cè)量。在有熒光發(fā)射的同時(shí)測(cè)量磷光磷光分析儀器應(yīng)用33單線態(tài)和三線態(tài)化學(xué)發(fā)光分析法一、基本原理A+B→C+D*D*→D+h

某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(zhǎng)的光（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機(jī)化合物，芳香族化合物（2）發(fā)光反應(yīng)多為氧化還原反應(yīng)，激發(fā)能與反應(yīng)能相當(dāng)

E=170～300kJ/mol；位于可見(jiàn)光區(qū)（3）發(fā)光持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，反應(yīng)持續(xù)進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)如果存在于生物體(螢火蟲(chóng))中，稱生物發(fā)光34單線態(tài)和三線態(tài)化學(xué)發(fā)光效率化學(xué)效率：發(fā)光效率：化學(xué)反應(yīng)所決定

化學(xué)反應(yīng)和環(huán)境因素化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(單位時(shí)間發(fā)射的光量子數(shù))：dc/dt是分析物參加反應(yīng)的速率

35單線態(tài)和三線態(tài)若化學(xué)發(fā)光反應(yīng)是一級(jí)動(dòng)力學(xué)反應(yīng)則即發(fā)光總強(qiáng)度與被測(cè)物濃度成線性：二、化學(xué)發(fā)光反應(yīng)類型1.直接化學(xué)發(fā)光和間接化學(xué)發(fā)光直接發(fā)光是被測(cè)物作為反應(yīng)物直接參加化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，生成電子激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子，此初始激發(fā)態(tài)能輻射光子

A+B

C*+DC*C+h

36單線態(tài)和三線態(tài)間接發(fā)光是被測(cè)物A或B，通過(guò)化學(xué)反應(yīng)生成初始激發(fā)態(tài)產(chǎn)物C*，C*不直接發(fā)光，而是將其能量轉(zhuǎn)移給F，使F躍遷回基態(tài)，產(chǎn)生發(fā)光。A+B

C*+DC*+FF*+EF*F+h

2.氣相化學(xué)發(fā)光和液相化學(xué)發(fā)光（1）氣相化學(xué)發(fā)光化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在氣相中進(jìn)行

主要有O3、NO、S的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，可用于監(jiān)測(cè)空氣中的O3、NO、SO2、H2S、CO、NO2等

NO+O3→NO2*NO2*→NO2+h

37單線態(tài)和三線態(tài)（2）液相化學(xué)發(fā)光

化學(xué)發(fā)光反應(yīng)在液相中進(jìn)行應(yīng)用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）；魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應(yīng)過(guò)程：魯米諾-H2O2發(fā)光反應(yīng)反應(yīng)速度慢，可檢測(cè)低至10-9mol/L的H2O2；38單線態(tài)和三線態(tài)生物發(fā)光生物發(fā)光是化學(xué)發(fā)光中的一類，特指在生物體內(nèi)通過(guò)化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來(lái)催化產(chǎn)生的。多種細(xì)菌、昆蟲(chóng)、魚(yú)類等均能發(fā)光39單線態(tài)和三線態(tài)熒光燈：當(dāng)高壓加在燈管兩端后，燈管內(nèi)少數(shù)電子高速撞擊電極后產(chǎn)生二次電子發(fā)射，開(kāi)始放電，管內(nèi)的水銀受電子撞擊后，激發(fā)輻射出253.7nm的紫外光，產(chǎn)生的紫外光激發(fā)涂在管內(nèi)壁上的熒光粉而產(chǎn)生可見(jiàn)光。（可見(jiàn)光的顏色將依據(jù)所選用的熒光粉的不同而不同）

40單線態(tài)和三線態(tài)熒光棒中的化學(xué)物質(zhì)主要由三種物質(zhì)組成：過(guò)氧化物、酯類化合物和熒光染料。簡(jiǎn)單地說(shuō)，熒光棒發(fā)光的原理就是過(guò)氧化物和酯類化合物發(fā)生反應(yīng)，將反應(yīng)后的能量傳遞給熒光染料，再由染料發(fā)出熒光。目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的熒光棒中通常放置了一個(gè)玻璃管夾層，夾層內(nèi)外隔離了過(guò)氧化物和酯類化合物，經(jīng)過(guò)揉搓，兩種化合物反應(yīng)使得熒光染料發(fā)光。

41單線態(tài)和三線態(tài)三、化學(xué)發(fā)光的測(cè)量?jī)x器儀器主要包括：樣品室、光檢測(cè)器、放大器和信號(hào)輸出裝置等部件42單線態(tài)和三線態(tài)熒光法測(cè)定維生素B2片劑中核黃素含量

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?．學(xué)習(xí)和掌握熒光光度分析方法2．了解熒光分光光度計(jì)的結(jié)構(gòu)及使用方法二、實(shí)驗(yàn)原理：維生素B2結(jié)構(gòu)式

維生素B2，又叫核黃素，橘黃色,無(wú)臭的針狀晶體易溶于水而不溶于乙醚等有機(jī)溶劑在中性或酸性溶液中穩(wěn)定光照易分解，對(duì)熱穩(wěn)定43單線態(tài)和三線態(tài)維生素B2水溶液在430-440nm藍(lán)光或紫外光照射下會(huì)發(fā)生綠色熒光，熒光峰在535nm,在pH=6-7溶液中熒光強(qiáng)度最大，在pH=11的堿溶液中熒光消失，所以可以用熒光光譜法測(cè)定維生素Ｂ2的含量三、實(shí)驗(yàn)用品：1．儀器：熒光分光光度計(jì)，移液管，容量瓶，棕色試劑瓶，比色管，燒杯，離心機(jī)，離心管2．藥品：核黃素（生化試劑），冰醋酸（AR）,鹽酸（AR）氫氧化鈉，市售維生素B2片劑44單線態(tài)和三線態(tài)四、實(shí)驗(yàn)步驟：1、試劑溶液的配制1）5％醋酸溶液

取5份冰醋酸與95份體積蒸餾水混合

2）10.0mg·L-1VB2標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取10.0mgVB2

將其溶解于少量的5%HAc中，轉(zhuǎn)移至1L容量瓶中用5%HAc

稀釋至刻度，該溶液應(yīng)裝于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存

3）待測(cè)液：取市售VB2一片，置于50mL燒杯中，加入約12mL5%HAc溶液，用玻璃棒搗碎藥片，水浴加熱使樣品由混濁變?yōu)榛就该骱笕∠吕鋮s，轉(zhuǎn)移并加入5%HAc溶液定容至100mL。取數(shù)毫升于離心管中進(jìn)行離心，用移液管準(zhǔn)確移取5mL的上層清液并定容成50mL，貯于棕色試劑瓶中，置陰涼處保存

45單線態(tài)和三線態(tài)2、激發(fā)光和熒光波長(zhǎng)的選擇準(zhǔn)確移取10.0mg·L-1VB