酶分子的化學(xué)修飾課件

第七章酶分子的化學(xué)修飾第七章酶分子的化學(xué)修飾1

酶作為生物催化劑，其高效性和專(zhuān)一性是其他催化劑所無(wú)法比擬的。因此，日益增多的酶制劑已用于食品發(fā)酵、疾病診治和預(yù)防、環(huán)境保護(hù)和監(jiān)測(cè)、化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，以及基因工程等生物技術(shù)領(lǐng)域。

但是酶在實(shí)際應(yīng)用中有局限性：1、作為異體蛋白在體內(nèi)難于吸收、易引起免疫反應(yīng)和被識(shí)別降解；2、酶蛋白經(jīng)不起溫度、酸堿、有機(jī)溶劑及時(shí)間的考驗(yàn)，半衰期短、易變性失活；3、酶的活性、作用專(zhuān)一性和最適條件不一定能適應(yīng)生產(chǎn)工藝要求，限制了酶制劑的應(yīng)用范圍。

酶作為生物催化劑，其高效性和專(zhuān)一性是其他催化劑2改變酶特性有兩種主要的方法：1)通過(guò)分子修飾的方法來(lái)改變已分離出來(lái)的天然酶的活性。蛋白質(zhì)水平2)通過(guò)基因工程方法改變編碼酶分子的基因而達(dá)到改造酶的目的。核酸水平改變酶特性有兩種主要的方法：3化學(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修飾條件，在保持酶活性的基礎(chǔ)上，能夠在較大范圍內(nèi)改變酶的性質(zhì)，創(chuàng)造天然酶所不具備的優(yōu)良特性，甚至創(chuàng)造出新的活性。

化學(xué)修飾方法雖多，但基本都是利用修飾劑所具有的各種化學(xué)基團(tuán)特性，或直接或經(jīng)過(guò)一定的活化過(guò)程，與酶分子上某氨基酸殘基（一般盡量選酶活性非必需基團(tuán)）產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造。第一節(jié)酶的化學(xué)修飾

（一級(jí)結(jié)構(gòu)水平的改造）

（原理、方法、應(yīng)用）

化學(xué)修飾是分子酶工程的重要手段之一。只要選擇合適的修飾劑和修4

一、化學(xué)修飾原理凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或除去而使酶蛋白共價(jià)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（側(cè)鏈基團(tuán)的取代、肽鏈的限制性水解、分子內(nèi)或分子間的交聯(lián)），都可稱為蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾。達(dá)到：改造酶的作用特性（包括改變酶活性、專(zhuān)一性、對(duì)效應(yīng)物響應(yīng)性能及對(duì)輔助因子的要求）提高酶的穩(wěn)定性擴(kuò)大在體內(nèi)應(yīng)用可能性（防止在體內(nèi)非專(zhuān)一性水解、減少和消除免疫原性以利于醫(yī)療應(yīng)用）一、化學(xué)修飾原理凡通過(guò)化學(xué)基團(tuán)的引入或5化學(xué)修飾效果舉例用纖維蛋白的專(zhuān)一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其溶血栓性提高了100倍。用乙醛酸修飾胰凝乳蛋白酶的表面氨基，形成親水性的α－NHCH2COOH后，該酶對(duì)60°C熱處理的穩(wěn)定性增高了1000倍。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)、L－谷氨酰胺酶、L－天門(mén)冬酰胺酶、尿酸酶等用PEG(聚乙二醇)修飾后，完全消除了酶的抗原性和免疫原性，減慢了它們?cè)趧?dòng)物血液循環(huán)中被清除的速度，酶的活力可以保存15％－45％?；瘜W(xué)修飾效果舉例用纖維蛋白的專(zhuān)一性單克隆抗體修飾尿激酶，使其61、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性

修飾劑分子存在多個(gè)反應(yīng)基團(tuán)，可與酶形成多點(diǎn)交聯(lián)。使酶的天然構(gòu)象產(chǎn)生“剛性”結(jié)構(gòu)。2、如何保護(hù)酶活性部位與抗抑制劑大分子修飾劑與酶結(jié)合后，產(chǎn)生的空間障礙或靜電斥力阻擋抑制劑，“遮蓋”了酶的活性部位。1、如何增強(qiáng)酶天然構(gòu)象的穩(wěn)定性與耐熱性73、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶酶化學(xué)修飾后通過(guò)兩種途徑抗蛋白水解酶：1.大分子修飾劑產(chǎn)生空間障礙阻擋蛋白水解酶接近酶分子?！罢谏w”酶分子上敏感鍵免遭破壞。2.酶分子上許多敏感基團(tuán)交聯(lián)上修飾劑后，減少了受蛋白水解酶破壞的可能性。3、如何維持酶功能結(jié)構(gòu)的完整性與抗蛋白水解酶84、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境1.酶蛋白氨基酸組成的抗原決定簇，與修飾劑形成了共價(jià)鍵。破壞了抗原決定簇——抗原性降低乃至消除“遮蓋”了抗原決定簇——阻礙抗原、抗體結(jié)合2.大分子修飾劑本身是多聚電荷體，能在酶分子表面形成“緩沖外殼”，抵御外界環(huán)境的極性變化，維持酶活性部位微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定。4、如何消除酶的抗原性及穩(wěn)定酶的微環(huán)境95、改變酶學(xué)性質(zhì)絕大多數(shù)酶經(jīng)過(guò)修飾后，最大反應(yīng)速度沒(méi)改變，但有些酶修飾后米氏常數(shù)會(huì)增大。原因可能是交聯(lián)于酶上的大分子修飾劑產(chǎn)生的空間障礙影響了底物對(duì)酶的接近和結(jié)合，但同時(shí)由于修飾酶穩(wěn)定性增強(qiáng)和半衰期延長(zhǎng)，可彌補(bǔ)Km值增大的缺陷。5、改變酶學(xué)性質(zhì)10二、化學(xué)修飾分類(lèi)（一）金屬離子置換修飾（二）大分子結(jié)合修飾（三）肽鏈有限水解修飾（四）酶蛋白側(cè)鏈基團(tuán)修飾（五）親和修飾（六）氨基酸置換修飾二、化學(xué)修飾分類(lèi)（一）金屬離子置換修飾11（一）金屬離子置換修飾1、概念2、作用范圍3、常用金屬離子4、方法步驟（一）金屬離子置換修飾1、概念121、概念通過(guò)改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改變的方法。1、概念通過(guò)改變酶分子中所含金屬離子，使酶的特性和功能發(fā)生改132、作用范圍含有金屬離子的酶金屬酶特點(diǎn)：金屬離子往往是酶活性中心的組成部分，對(duì)酶的活性起重要作用。（1）若除去酶活性中心的金屬離子，酶會(huì)失活，重新加入原離子則酶復(fù)活。（2）加入不同的金屬離子（即金屬離子置換）則可使酶呈現(xiàn)不同特性。2、作用范圍含有金屬離子的酶143、常用金屬離子（往往是二價(jià)離子）:Ca2+，Mg2+，Mn2+，Zn2+，Co2+，Cu2+，F(xiàn)e2+等。3、常用金屬離子154、方法步驟向酶液加入一定量的EDTA－將酶與金屬鰲合物分離－金屬離子置換。4、方法步驟16５、舉例淀粉酶：一般的α-淀粉酶是多離子型的，含Ca2+、Mg2+、Zn2+等若把其它的離子都換為鈣離子，活力及穩(wěn)定性均提高。所以淀粉酶的生產(chǎn)、保存和應(yīng)用中可添加一定量的鈣離子。將鋅型蛋白酶的Zn2+除去，然后用Ca2+置換成鈣型蛋白酶，則酶活力可提高20-30%。若將鈣型蛋白酶制成結(jié)晶，則其酶活力比鋅型蛋白酶結(jié)晶的酶活力提高2-3倍。５、舉例17（二）大分子結(jié)合修飾1、概念2、通常使用的水溶性大分子修飾劑3、修飾方法4、大分子修飾后酶性質(zhì)的變化（二）大分子結(jié)合修飾1、概念181、概念：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念：利用水溶性大分子與酶結(jié)合，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)的192、通常使用的水溶性大分子修飾劑聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐（dextran）、肝素（heparin）、蔗糖聚合物（Ficoll）等。修飾方法：修飾前活化，然后在一定條件下與酶分子共價(jià)結(jié)合。2、通常使用的水溶性大分子修飾劑20聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性、無(wú)殘留、無(wú)免疫原性，并可消除酶的抗原性，使其末端活化后可以與酶產(chǎn)生交聯(lián)，因而，它被廣泛用于酶的修飾。酶半衰期相對(duì)穩(wěn)定性天然SOD6min1右旋糖酐-SOD7h70Ficoll(低分子量)–SOD14h140Ficoll(高分子量)–SOD24h240聚乙二醇-SOD35h350聚乙二醇是線性分子具有良好的生物相容性和水溶性，在體內(nèi)無(wú)毒性213、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結(jié)合－對(duì)酶分子進(jìn)行修飾3、修飾方法修飾劑活化－與酶分子結(jié)合－對(duì)酶分子進(jìn)行修飾224、大分子修飾后酶性質(zhì)的變化（1）提高酶活力（2）增加酶的穩(wěn)定性半衰期：酶活力降低原來(lái)活力一半所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。（2）降低抗原抗體反應(yīng)1.抗原2.抗體免疫抗原性抗原性反應(yīng)抗原性4、大分子修飾后酶性質(zhì)的變化（1）提高酶活力23例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延長(zhǎng)了酶在體內(nèi)的半衰期從而提高了酶藥效。每分子核糖核酸酶與6.5分子的右旋糖酐結(jié)合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍；每分子胰凝乳蛋白酶與11分子右旋糖酐結(jié)合，酶活力達(dá)到原有酶活力的5.1倍5.實(shí)例例如：用聚乙二醇修飾超氧物歧化酶，不僅可以降低或消除酶的抗24（三）肽鏈有限水解修飾1、概念2、修飾后酶性質(zhì)的變化3、修飾劑（三）肽鏈有限水解修飾1、概念251、概念利用肽鏈有限水解，使酶的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生精細(xì)的改變，從而改變酶的特性與功能的方法。1、概念26酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：1

引起酶活性中心的破壞，酶失去催化功能。2仍維持活性中心的完整構(gòu)象，保持酶活力。3有利于活性中心與底物結(jié)合并形成準(zhǔn)確的催化部位，酶活力提高。后兩種情況，肽鏈的水解在限定的肽鍵上進(jìn)行，稱肽鏈有限水解。酶蛋白的肽鏈被水解后，可能出現(xiàn)以下三種情況中的一種：272、修飾后酶性質(zhì)的變化（1）提高酶活力（2）降低或消除抗原性2、修飾后酶性質(zhì)的變化283、修飾劑專(zhuān)一性較強(qiáng)的蛋白酶或肽酶3、修飾劑294.實(shí)例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶原的激活

4.實(shí)例酶蛋白主鏈修飾主要是靠酶切/酶原激活法。a、胃蛋白酶30酶分子的化學(xué)修飾課件31b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活32酶分子的化學(xué)修飾課件33（四）酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾1.定義采用一定的方法（一般為化學(xué)法）使酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)發(fā)生改變，從而改變酶分子的特性和功能的修飾方法。（四）酶分子的側(cè)鏈基團(tuán)修飾1.定義34可以用于研究各種基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功能的影響。在研究酶的活性中心中的必需基團(tuán)時(shí)經(jīng)常采用。酶蛋白的側(cè)鏈基團(tuán)是指組成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基上的功能團(tuán)。主要包括氨基、羧基、巰基、胍基、酚基等。這些基團(tuán)可以形成各種副鍵，對(duì)酶蛋白空間結(jié)構(gòu)的形成和穩(wěn)定有重要作用。側(cè)鏈基團(tuán)一旦改變將引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的特性和功能?？梢杂糜谘芯扛鞣N基團(tuán)在酶分子中的作用及其對(duì)酶的結(jié)構(gòu)、特性和功35（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基發(fā)生反應(yīng)的小分子化合物稱為羧基修飾劑。修飾劑:碳化二亞胺、甲醇-HCL、乙醇-HCL含有羧基的氨基酸：天門(mén)冬氨酸、谷氨酸等（1）羧基修飾劑可與酶蛋白側(cè)鏈上的羧基發(fā)生反應(yīng)的小分子化合物36常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（酰胺化）：羧基見(jiàn)292頁(yè)常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（酰胺化）：羧基見(jiàn)292頁(yè)37（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物稱為氨基修飾劑。修飾劑:乙酸酐、二硝基氟苯、碘代乙酸等。含有氨基的氨基酸：賴氨酸等（2）氨基修飾劑凡能使酶蛋白側(cè)鏈上的氨基發(fā)生改變的化合物稱為38常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（甲基化與乙?；喊被Ｒ?jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（甲基化與乙?；喊被?9（3）巰基修飾劑兩個(gè)巰基可以形成二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由于巰基具有很強(qiáng)的親核性，巰基一般是蛋白質(zhì)分子中最容易反應(yīng)的側(cè)鏈基團(tuán)。修飾劑：二硫蘇糖醇、巰基乙醇、硫代硫酸鹽等（3）巰基修飾劑兩個(gè)巰基可以形成二硫鍵穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，由于巰40常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（烷基化）：巰基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)（烷基化）：巰基41（4）酚羥基修飾劑蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚羥基。修飾方法：碘化法、硝化法等修飾劑：N-乙酰咪唑、碘、四硝基甲烷等。（4）酚羥基修飾劑蛋白質(zhì)的酪氨酸殘基上含有酚羥基。42常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：酚羥基43（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個(gè)強(qiáng)堿性的胍基，很難被修飾，而一些二羰基化合物能夠在中性或弱堿性條件下與精氨酸反應(yīng)，目前關(guān)于精氨酸的修飾的研究主要集中在二羰基化合物上。（5）胍基修飾劑精氨酸殘基含有一個(gè)強(qiáng)堿性的胍基，很難被修飾，44常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基常見(jiàn)基團(tuán)的化學(xué)修飾反應(yīng)：胍基45指修飾劑與底物相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，對(duì)酶活性部位具有特異的親和性，只對(duì)活性部位的氨基酸殘基進(jìn)行共價(jià)修飾的方法，也稱位點(diǎn)專(zhuān)一性修飾。作用原理與專(zhuān)一性不可逆抑制劑相同。

(五)親和修飾指修飾劑與底物相類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，對(duì)酶活性部位具有特異的親和性，只46(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸，引起酶蛋白空間構(gòu)象的改變，從而改變酶的某些特性和功能的方法。

通過(guò)兩個(gè)途徑實(shí)現(xiàn)：化學(xué)修飾法：由于可用試劑的限制，獲得的種類(lèi)少。蛋白質(zhì)工程：定點(diǎn)突變技術(shù)。(六)氨基酸置換修飾將肽鏈上的某一個(gè)氨基酸換成另一個(gè)氨基酸47例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性中心的絲氨酸轉(zhuǎn)換為半胱氨酸，修飾后，該酶失去對(duì)蛋白質(zhì)和多肽的水解能力，卻出現(xiàn)了催化硝基苯酯等底物水解的活性。但是化學(xué)修飾法難度大，成本高，專(zhuān)一性差，而且要對(duì)酶分子逐個(gè)進(jìn)行修飾，操作復(fù)雜，難以工業(yè)化生產(chǎn)。

例如，Bender等成功地利用化學(xué)修飾法將枯草桿菌蛋白酶活性48定點(diǎn)突變技術(shù)（sitedirectedmutagenesis）是20世紀(jì)80年代發(fā)展起來(lái)的一種基因操作技術(shù)。是指在DNA序列中的某一特定位點(diǎn)上進(jìn)行堿基的改變從而獲得突變基因的操作技術(shù)。定點(diǎn)突變技術(shù)為氨基酸或核苷酸的置換修飾提供了先進(jìn)、可靠、行之有效的手段。定點(diǎn)突變技術(shù)（sitedirectedmutagenes49酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析2、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析3、酶活性中心分析4、引物設(shè)計(jì)進(jìn)行基因定點(diǎn)突變5、酶基因克隆表達(dá)6、變異特性分析酶分子的定點(diǎn)突變1、基因序列分析50三、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用

在醫(yī)藥方面：化學(xué)修飾可以提高醫(yī)用酶的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)它在體內(nèi)半衰期，抑制免疫球蛋白的產(chǎn)生，降低免疫原性和抗原性。

在生物技術(shù)領(lǐng)域：化學(xué)修飾酶能夠提高酶對(duì)熱，酸，堿和有機(jī)溶劑的耐性，改變酶的底物專(zhuān)一性和最適pH等酶學(xué)性質(zhì)。

在酶結(jié)構(gòu)功能研究中：1.研究酶空間結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，如酶的活性中心研究；2.確定氨基酸殘基的功能；3.測(cè)定酶分子中某種氨基酸的數(shù)量。三、酶化學(xué)修飾的應(yīng)用在醫(yī)藥方面：化學(xué)修飾可以提高醫(yī)用51四、酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.擴(kuò)散速度受限2.生物活性降低3.修飾劑呈現(xiàn)多種聚合度、選擇性不夠高，修飾后的酶分子相對(duì)分子質(zhì)量分布寬、穩(wěn)定性不夠理想等四、酶蛋白化學(xué)修飾的局限性1.擴(kuò)散速度受限52第二節(jié)酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大的提高。抗原性：比較公認(rèn)的是PEG和人血清白蛋白在消除酶的抗原性上效果比較明顯。各類(lèi)失活因子的抵抗力：修飾酶對(duì)蛋白酶、抑制劑均有一定的抵抗能力，從而提高其穩(wěn)定性。第二節(jié)酶修飾后的性質(zhì)變化熱穩(wěn)定性：一般來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性有較大53半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，增強(qiáng)對(duì)熱、蛋白酶、抑制劑等的穩(wěn)定性，從而延長(zhǎng)了在體內(nèi)的半衰期。最適pH：大部分酶經(jīng)化學(xué)修飾后，酶的最適pH發(fā)生了變化，這種變化在應(yīng)用研究上有時(shí)具有重要意義。修飾酶最適pH更接近于生理環(huán)境，在臨床應(yīng)用上有較大意義。Km的變化：大多數(shù)酶經(jīng)修飾后，Vm沒(méi)有明顯變化，但有些酶經(jīng)修飾后，Km值變大。半衰期：一般在體內(nèi)的半衰期得到有效延長(zhǎng)。由于酶分子經(jīng)修飾后，54表6-1天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較

酶

修飾劑

修飾酶

天然酶

處理?xiàng)l件(℃/時(shí)間)

殘留酶活(%)酰苷脫氫酶

胰蛋白酶

過(guò)氧化氫酶

溶菌酶

尿激酶糜蛋白酶

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

右旋糖苷

人血清白蛋白

肝素

37/100min

100/30min

50/10min

100/30min

37/48h

37/24h

70

100

46

64

40

90

20

99

80

0

95

50表6-1天然酶和修飾酶的熱穩(wěn)定性比較酶修飾劑修飾酶55酶L-Asn酶SOD酶

Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶Arg酶過(guò)氧化氫酶胰蛋白酶抗原性修飾劑-葡萄糖苷酶核糖核酸酶酶PEGPEGPEGPEGPEGPEG白蛋白白蛋白白蛋白Poly-DL-Ala消除消除消除消除消除消除消除降低降低消除表6-2修飾酶的抗原性變化酶L-Asn酶SOD酶Gln-Aln酶尿酸酶腺苷脫氫酶56表6-3天然酶和修飾酶抗失活因子能力比較酶抗抑制劑抗蛋白酶修飾劑抗失活劑過(guò)氧化氫酶核糖核酸酶溶菌酶胰蛋白酶-葡萄糖苷酶尿激酶右旋糖苷右旋糖苷右旋糖苷右旋