人工口服感染克氏原螯蝦的消化道組織和血淋巴細(xì)胞內(nèi)分布

人工口服感染克氏原螯蝦的消化道組織和血淋巴細(xì)胞內(nèi)分布

血液抑郁癥（wssv）是線性病毒科（nimavidius）屬于白色斑點(diǎn)病毒。1材料和方法1.1動(dòng)物分子組織學(xué)檢測(cè)白斑綜合征病毒浙江株(WSSV-ZJ)系2001年從浙江省寧波地區(qū)典型感染W(wǎng)SSV的中國(guó)對(duì)蝦(Penaeuschinensis)組織中分離的野生毒株,由浙江大學(xué)教育部動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室鑒定、保存。1.2試驗(yàn)動(dòng)物健康活潑、螯肢完整的克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)購(gòu)自農(nóng)貿(mào)市場(chǎng),體重(23.0±0.2)g,飼養(yǎng)于水產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室。1.3wssv-zj株的感染取試驗(yàn)螯蝦40尾(實(shí)驗(yàn)前取血淋巴經(jīng)PCR檢測(cè)無(wú)WSSV感染),分為感染和對(duì)照2個(gè)組,每組20尾,飼養(yǎng)于250L玻璃水族箱內(nèi),每箱10尾。水溫22～24℃,24h連續(xù)充氣,感染前饑餓48h。將冰凍感染W(wǎng)SSV-ZJ株的中國(guó)對(duì)蝦頭部組織切成均勻的碎塊,以2%的比例投喂感染組,連續(xù)投喂2天,每天2次,對(duì)照組投喂顆粒餌料。觀察螯蝦的臨床癥狀、病程發(fā)展情況及死亡率。1.4組織病理學(xué)檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)束后,解剖取得感染組瀕死蝦和對(duì)照組存活蝦的胃、中腸及肝胰腺組織,一部分用Davidson’sAFA液固定,分別用于HE染色光鏡觀察和原位雜交檢測(cè);另一部分上述組織及血淋巴以2.5%戊二醛固定制備電鏡樣品。1.5石蠟包埋石將樣品置于組織脫水機(jī)(LeicaTP1020)中進(jìn)行乙醇系列脫水及二甲苯透明,在組織包埋機(jī)(LeicaEG1160)上進(jìn)行石蠟包埋。用石蠟切片機(jī)(LeicaRM2135)進(jìn)行連續(xù)切片,厚約6μm,用毛筆將切片移至展片機(jī)(LeicaHI1210)內(nèi)展片和沾片,再置于染色機(jī)(LeicaAutostainbrXL)內(nèi)HE染色,中性樹膠封片,在LeicaQwin圖像分析儀上觀察拍照。1.6載玻片的載玻片片制備組織樣品以Davidson’sAFA固定液固定24h后置于70%酒精中,制成5μm的石蠟切片,展片于用500μl/ml多聚賴氨酸預(yù)包的載玻片上。組織切片經(jīng)脫蠟、復(fù)水和蛋白酶K溶液(0.1mg/ml)消化,在42℃濕盒中預(yù)雜交30min,濕盒內(nèi)加變性DIG標(biāo)記WSSV特異性核酸探針(大小547bp,濃度30～50ng/ml,按雷質(zhì)文等的方法制備1.7電子顯微鏡樣品的制備取胃、中腸及肝胰腺等組織迅速切成1mm2結(jié)果2.1發(fā)病蝦及對(duì)照存活率不同投喂感染第3天試驗(yàn)組螯蝦開始死亡,第5～6天出現(xiàn)發(fā)病高峰,第8天死亡率可達(dá)100%,而對(duì)照組存活率為100%。發(fā)病螯蝦呈現(xiàn)明顯的臨床癥狀:(1)對(duì)外界的刺激反應(yīng)遲鈍,停止攝食,行動(dòng)遲緩,腹節(jié)卷曲,螯肢無(wú)力;(2)瀕死蝦甲殼易與其下的表皮分離,血液顏色微紅,血淋巴稀薄且不易凝固;肝胰腺顏色淡黃,普遍存在空胃現(xiàn)象。2.2感染的分離、鑒定對(duì)照組螯蝦的胃、中腸和肝胰腺組織經(jīng)HE染色,細(xì)胞核呈藍(lán)色,細(xì)胞質(zhì)呈紅色,細(xì)胞形態(tài)清晰,組織結(jié)構(gòu)完整(圖1-1,圖1-3,圖1-5)。病毒感染瀕死螯蝦胃(圖1-2)、中腸(圖1-4)組織的上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞呈現(xiàn)典型的病變特征,核腫大多呈球形或短橢圓形,嗜伊紅深染;肝胰腺組織的細(xì)胞,核內(nèi)染色質(zhì)、核仁消失;細(xì)胞膜、細(xì)胞形態(tài)模糊不清,結(jié)締組織糜爛,只剩少量核及細(xì)胞殘屑,壞死上皮及肌束間均有腫大的離散細(xì)胞核(圖1-6)。2.3各組螯蝦的雜交行為感染W(wǎng)SSV-ZJ株瀕死螯蝦的胃、中腸和肝胰腺組織的上皮細(xì)胞和結(jié)締組織細(xì)胞均可見明顯的陽(yáng)性雜交信號(hào)(圖2-2,圖2-4,圖2-6),對(duì)照組螯蝦的組織細(xì)胞均呈陰性雜交反應(yīng)(圖2-1,圖2-3,圖2-5)。2.4桿狀病毒粒子的檢測(cè)在病毒感染的組織超薄切片中,完整病毒粒子的縱切面呈長(zhǎng)橢圓形,橫切面為圓形,中間濃染部分是核蛋白構(gòu)成的髓核,外面包裹一層染色稍淺的蛋白質(zhì)衣殼,共同組成核衣殼,最外層是脂雙層囊膜,病毒粒子大小約(182～318)nm×90nm,雙層囊膜厚約14nm(圖3-1,圖3-2)。密集的桿狀病毒粒子在細(xì)胞核內(nèi)可形成局部晶格狀排列,但不形成核型多角體或顆粒體類包埋體(圖3-1),并可見一端具有“乳頭狀突起”的病毒粒子和正在裝配囊膜的空衣殼(圖3-2)。宿主細(xì)胞的特征性超微病理變化是細(xì)胞核腫漲,充滿大量的病毒粒子,染色質(zhì)邊移乃至消失,核膜難以辯認(rèn),細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)逐漸潰散(圖3-3,圖3-4,圖3-10);線粒體大量壞死,嵴斷裂、脫落,內(nèi)外膜破裂或彼此分離(圖3-5,圖3-7),粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生、斷裂、嚴(yán)重?cái)U(kuò)張,或呈指紋樣結(jié)構(gòu)(圖3-6,圖3-8)。對(duì)照組螯蝦的細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)完整,未見有桿狀病毒粒子(圖3-9)。3wssv的傳播途徑流行病學(xué)調(diào)