微生物的分離培養(yǎng)和菌種保藏

實驗七微生物的分離、培育和菌種保藏

微生物的分離、培育和菌種保藏目的要求實驗材料試驗程序思考題目的要求初步掌握微生物的分離、培育和菌種保藏的基本方法。練習微生物接種、移植和培育的基本技術(shù)，掌握無菌操作技術(shù)。實驗材料樣品：新奇土壤。培育基：滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培育基、淀粉瓊脂培育基、馬鈴薯蔗糖培育基（10mL裝）。無菌水：帶有玻璃珠裝有45mL無菌水三角瓶、裝有9mL無菌水的試管。其它：無菌培育皿、無菌吸管、無菌三角玻棒、臺天平、記號筆、接種環(huán)、酒精燈、火柴、標簽紙、膠水、水浴鍋。試劑：5000U/mL鏈霉素液0.5％重鉻酸鉀液實驗程序微生物的分離微生物的接種方法（示范）微生物培育中的氧氣條件微生物的菌種保藏方法四大類微生物菌落形態(tài)的比較和識別實驗程序1

（微生物的分離）用稀釋平板法（又名混菌法）從土壤中分離真菌。用平板涂抹法分離土壤中的放線菌（土壤稀釋液制備同上）。用平板劃線法分離土壤中的細菌（土壤稀釋液的制備同上）。實驗程序2

（微生物的分離—稀釋平板法）制備土壤稀釋液：(無菌操作過程見老師示范）1.稱取土壤5g，放入45mL無菌水的三角瓶中，振蕩10min，即為稀釋10－1的土壤懸液。2.另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上10－2、10－3、10－4、10－5、10－6。取已稀釋成10－1的土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌吸管吸取1mL土壤懸液加入10－2的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成10－2土壤稀釋液。同法依次連續(xù)稀釋至10－410－510－6土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，應用一支吸管由濃到稀，稀釋到底，稀釋方法見圖-1。實驗程序3

（微生物的分離—稀釋平板法）圖－1土壤稀釋液的制備和稀釋液的取樣實驗程序4

（微生物的分離—稀釋平板法）涂平板：每組取培育皿2付，即每個同學做一只。1.先在無菌培育皿底部貼上標簽，注明分離菌名、稀釋度、組別、班級。2.另取一吸管，以無菌操作法吸取10－4或10－5土壤稀釋液1mL，加在無菌培育皿的一邊，在皿的另一邊加入2滴5000U/mL的鏈霉素液。此時兩液嚴防相混。3.取已熔化的在水浴鍋中保溫500C左右的馬鈴薯蔗糖培育基2管，分別倒入上述培育皿中（見圖－2），輕輕轉(zhuǎn)動培育皿，使菌液、鏈霉素液、培育基充分混勻鋪平，放在平坦的桌面上，凝固后，倒置于28～300C恒溫培育5～6d。觀察真菌菌落形態(tài)以及計數(shù)菌落。并計算出每g土壤中真菌的數(shù)量。即用某一培育皿內(nèi)真菌的菌落數(shù)乘以該培育皿接種液的稀釋倍數(shù)即得。挑取單個菌落，接種到斜面培育基上作純化和性能測定，若不純，需要連續(xù)分離。實驗程序5

（微生物的分離—稀釋平板法）實驗程序6（微生物的分離—平板涂抹法）每組取無菌培育皿2付（每個同學做一只）。在皿底貼上標簽，注明分離菌名、稀釋度、組別、班級。以無菌操作法先在培育皿中加入0.5％重鉻酸鉀溶液2滴，取已熔化的淀粉瓊脂培育基2管，分別倒入培育皿，使培育基與重鉻酸鉀充分混勻，鋪平，制成平板。凝固后，另取一支吸管吸取10－3或10－4的土壤稀釋液0.2mL放在平板上。用無菌三角玻棒將稀釋液在平板表面涂抹均勻。倒置于28～300C條件下培育6～7d，觀察放線菌菌落形態(tài)及計數(shù)菌落，并計算出每g土壤中放線菌的數(shù)量（方法同上）。挑取單個菌落，接種于相應的斜面培育基上，如果不純，再移植純化，至最后得到純培育為止。實驗程序7（微生物的分離—平板涂抹法）實驗程序8（微生物的分離—平板劃線法）每組取無菌培育皿2付，在皿底貼上標簽，注明事項。取已熔化的牛肉膏蛋白胨培育基，倒入平皿，制成平板。凝固后，用接種環(huán)取相應的菌液一環(huán)（10－5或10－6）在平板上劃線（老師作示范）。1.連續(xù)劃線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培育基表面作連續(xù)劃線（圖－5）。完畢后，倒置于28～300C溫室培育。2.分區(qū)劃線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤稀釋液1環(huán)，先在培育基的一邊作第一次平行劃線3—4條，再轉(zhuǎn)動培育皿約600C角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作其次次劃線會，同法依次作第三次和第四次劃線（見圖－5）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28～300C溫室培育。挑取單個菌落接種于斜面培育基上，如果不純，再移植純化，最后得到純培育。實驗程序9（微生物的分離—平板劃線法）實驗程序10（微生物的接種方法）接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培育基的穿刺接種法。接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等（見圖－6）。圖－6試驗程序11（微生物的接種方法—斜面接種法）實驗程序12（微生物的接種方法—斜面接種法）左手平托兩支試管，拇指按住試管底部。外側(cè)使是菌種試管，內(nèi)側(cè)是待接的空白斜面。（兩支試管的斜面同時向上），右手將棉塞旋松，以便在接種時容易拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上先將環(huán)端燒紅滅菌，然后將有可能伸入試管的其余部位也過火滅菌。將兩支試管的上端并齊，靠近火焰，用右手小指和掌心將兩支試管的棉塞一并夾住拔出，棉塞仍夾在手中，然后讓試管口緩緩過火焰。將已灼燒過的接種環(huán)伸入外側(cè)的菌種試管內(nèi)。先冷卻，而后再用環(huán)沾取肯定量的菌苔，將沾有菌苔的接種環(huán)抽出試管。實驗程序13（微生物的接種方法—斜面接種法）飛快將沾有菌種的接種環(huán)伸入另一支待接斜面試管的底部，輕輕向上劃線（直線或曲線）。接好種的斜面試管口再次過火焰，棉塞底部過火焰后立即塞入試管內(nèi)。將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，使菌體爆濺，造成污染。放下環(huán)后，再將棉塞旋緊，在試管斜面上距試管口2～3cm處貼上標簽。28～370C恒溫培育。實驗程序14（微生物的接種方法—液體接種和穿刺接種）液體接種法：包括從斜面菌種接入培育液，或從液體菌種接入液體培育液，兩種情況都可以用接種環(huán)接種。但在培育量比較大的情況下，液體接種宜采納移液管接種，同時要求無菌操作。穿刺接種法：用接種針經(jīng)火焰滅菌后，沾取少量菌種，垂直地穿入試管固體培育基中心至底部，然后沿著原接種線將針拔出，要做到手穩(wěn)、動作輕松飛快，最后塞上棉塞。再將接種針上殘留的菌體在火焰上燒掉。實驗程序15（微生物的接種方法—液體接種和穿刺接種）實驗程序16（微生物培育中的氧氣條件）參觀培育設備：包括接種室、恒溫培育室、恒溫培育箱、液體發(fā)酵——搖床、厭氧培育罐等。好氧培育：例如平板培育、斜面培育、淺層液體培育、液體振蕩培育或通氣攪拌培育等都屬于好氧培育的方法。厭氧培育：除了最簡便的深層液體培育以外，可以采納物理、化學或生物學的方法來排解培育容器中的空氣或空氣中的氧氣，制造厭氧條件。對于嚴格厭氧的微生物，要用化學和物理并用的方法。厭氧培育罐（圖－9），以某種氣體取代培育容器中空氣，并添加還原劑，如產(chǎn)氣袋法和換氣法。在進行厭氧培育時，可以用指示劑檢查系統(tǒng)中的還原條件，一般實驗室中常用的如葡萄糖——美蘭指示劑。實驗程序17（微生物培育中的氧氣條件－厭氧培育）美蘭氧化還原指示劑：0.006N

NaOH0.015%美蘭溶液6％葡萄糖溶液上列三種溶液在使用時等量混合，加熱使美蘭退色，飛快放入?yún)捬豕拗?。實驗程?8（微生物培育中的氧氣條件－厭氧培育）實驗程序19（微生物培育中的氧氣條件－厭氧培育）生物學方法：利用植物呼吸作用，造成厭氧條件，常用的方法是在密封的干燥器底部放入發(fā)芽種子，因種子的呼吸作用增強，汲取氧氣，制造厭氧條件。此法簡易，但厭氧程度低?；瘜W方法：利用焦性沒食子酸汲取容器中的氧氣。在容器的一邊放一包用吸水紙包好的焦性沒食子酸，在另一邊放入堿液，容器密封后，讓堿液流向焦性沒食子酸一邊，兩者反應時汲取容器中的氧氣，制造厭氧條件。物理方法：常用真空泵抽出密封干燥器內(nèi)的空氣或再充入其它惰性氣體，以保證厭氧條件。抽氣前，容器內(nèi)放入指示劑和培育物。一般為達到嚴格厭氧目的，常采納物理和化學相結(jié)合并用的方法。實驗程序20（微生物的菌種保藏方法）菌種保藏是微生物學工作中的重要一環(huán)，微生物菌種保藏的目的要求達到以下三點：1.保持原種外形,延緩或防止退化。2.保持活力而不死。3.保證純培育，防止污染。微生物菌種保藏的關(guān)鍵是使微生物代謝作用緩慢，處于休眠狀態(tài)。為此，要求降低其體內(nèi)酶的活性。一般采納低溫、干燥和缺氧條件來實現(xiàn)。菌種保藏的方法有:冰箱斜面保藏、石蠟封藏法、砂土管保藏法、冷凍低溫干燥法和液氮保藏法等。實驗程序21（微生物的菌種保藏方法）斜面冰箱保藏法：將菌種接在新奇斜面培育基上，定溫培育長出豐滿菌苔后，一般形成芽孢的細菌要形成芽孢，形成孢子的微生物要長出孢子，貼上標簽，放在試管架上，在棉塞部位用尼龍紙或防水紙包好，放入40C冰箱中保藏。一般每隔3個月至半年用新奇培育基移植1次。方法簡便，實驗室均采納。缺點：移接代數(shù)太多，易產(chǎn)生變異、退化。石蠟封藏法：在已長好的斜面菌種上加入無菌液體石蠟油，高出斜面1cm直立試管放入冰箱保藏，適用保存細菌和放線菌。石蠟的處理：250mL三角瓶裝100mL液體石蠟，1.05kg/cm3高壓滅菌30min，然后放在1050C左右的烘箱中1h，使水分蒸發(fā)掉。實驗程序22（微生物的菌種保藏方法）砂土管保藏法：(可用于保藏產(chǎn)孢子的放線菌、霉菌和產(chǎn)芽孢的細菌）。1.砂土管的制備：取河沙若干，用40目過篩，出去大顆粒，加10％HCl后煮沸30min，除去有機質(zhì)（也可用10％HCl浸泡2—4h)。最后倒去酸水，用自來水沖洗至中性，烘干備用。另取0.3m以下非耕作層的瘦黃土若干，曬干磨細，過120目篩。2.按土：砂＝1：4的比例均勻混合，裝入指形管中，以1cm高為宜，塞上棉塞，160～1700C干熱滅菌2h。3.在新奇菌種斜面上加入3mL左右的無菌水，用無菌接種環(huán)制成菌懸液，用無菌吸管吸取0.2～0.3mL的菌懸液放入每個砂土管中，用接種環(huán)拌勻，并貼上標簽，注明菌名。4.菌液加好后，立即進行抽真空干燥，要求在24h內(nèi)抽干，尤其是夏天要求較短時間內(nèi)抽干。搖散砂土，放干燥器內(nèi)冰箱保藏。實驗程序23（微生物的菌種保藏方法）冷凍真空干燥保藏法：此法一般常用于細菌或病毒一類的菌種保藏，常用脫脂牛奶或血清作為菌種的保護劑。1.脫脂牛奶的制法：將牛奶加熱到800C左右，然后冷卻，除去表面的一層脂肪。這樣反復2—3次后用脫脂棉花過濾，并在3000r/min的離心15min，再除去表面脂肪。將脫脂牛奶裝入三角瓶中，用0.5kg/cm2高壓滅菌30min，連續(xù)2次，并作無菌試驗。

2.用無菌的脫脂牛奶將新奇斜面菌種制成牛奶菌種懸液，無菌操作裝入安瓿管中（裝量不超過其體積的1/3)。3.預凍：將分裝好的安瓿管在－25～－400C之間的干冰酒精中進行預凍，1h后即可抽氣進行真空干燥。4.真空干燥：預凍后放入真空干燥箱中，開啟真空泵進行干燥。5.封管前將安瓿管裝入多歧管上，開啟真空泵，當真空度達到0.01mm汞柱后用火焰熔封。6.做好的安瓿管放入冰箱中保藏。實驗程序24（四大類微生物菌落形態(tài)的比較和識別）區(qū)分和識別各