甲苯和二甲基亞對斑馬魚胚胎生長和發(fā)育的影響

甲苯和二甲基亞對斑馬魚胚胎生長和發(fā)育的影響

一般溶劑二甲基亞（丙酮醇）、丙酮和乙醇濃度在正常濃度下，對一般環(huán)境毒性動物（如魚類和雙棲動物）沒有顯著的毒性影響。甲苯作為一種常見的有機溶劑,其脂溶性高,揮發(fā)性較強,可通過鰓、體表進入魚體,能輕易透過血腦屏障,進而抑制乙酰膽堿酯酶活性,并造成神經(jīng)系統(tǒng)功能損傷、影響神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育,具有明顯的神經(jīng)毒性效應(yīng)在本研究中,選取低劑量的甲苯(0.05%)和不高于0.45%的DMSO,研究助溶劑單一、復(fù)合暴露后,對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性效應(yīng);同時,為進一步驗證斑馬魚胚胎毒性實驗結(jié)果,選擇人胚腎293細胞株和人胃癌7901細胞株,研究助溶劑對離體細胞活力的影響,以綜合評價其毒性效應(yīng).1實驗方法1.1實驗材料將性成熟斑馬魚(1.2染毒斑馬魚胚胎發(fā)育情況觀察挑選正常發(fā)育的受精卵,3hpf開始染毒進行暴露實驗.實驗于直徑為7cm的玻璃表面皿中進行,所用水均取自系統(tǒng)曝氣水.試驗濃度為:0(對照組)、0.05%甲苯、0.45%DMSO、0.1%(DMSO+甲苯)、0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)(在特定時間段(受精后12h,36h,60h,84h,108h,132h,156h等)對染毒斑馬魚胚胎死亡數(shù)、孵化數(shù)進行統(tǒng)計.觀察胚胎的形態(tài)變化,如:發(fā)育停滯、心包水腫、卵黃水腫、脊柱卷曲等畸形狀況.1.3細胞密度和細胞密度的檢測MTT比色法測定細胞活力.人胚腎HEK-293細胞株和人胃癌SGC-7901細胞株分別使用DMEM培養(yǎng)基和RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng).用0.25%胰蛋白酶消化處于對數(shù)生長期的細胞,加入新鮮培養(yǎng)基輕輕吹打制成細胞懸液,用血細胞記數(shù)板計算細胞密度,用培養(yǎng)基稀釋到1×10采用SPSS10.0分析全部數(shù)據(jù),實驗結(jié)果用平均值±標準誤差表示.2結(jié)果與討論2.1dmso和甲苯對斑馬魚胚胎孵化的影響甲苯和DMSO復(fù)合暴露對斑馬魚胚胎的致死效應(yīng)如圖1A所示.與對照組相比,隨著暴露時間的延長,0.45%DMSO單一暴露組對斑馬魚胚胎沒有顯著致死效應(yīng),0.05%甲苯單一暴露組的胚胎死亡率為12%(156hpf),0.1%(DMSO+甲苯)助溶劑復(fù)合物對斑馬魚胚胎的死亡率無明顯效應(yīng);但0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)助溶劑復(fù)合物可明顯提高斑馬魚胚胎的死亡率,暴露到156hpf時,0.3%(DMSO+甲苯)助溶劑復(fù)合物可造成39%的斑馬魚胚胎死亡,而0.5%(DMSO+甲苯)暴露組斑馬魚胚胎死亡率為74%,這表明,隨著助溶劑復(fù)合物中DMSO含量的增加,斑馬魚胚胎的死亡率顯著上升.甲苯和DMSO各暴露組對斑馬魚胚胎孵化率的影響如圖1B所示.對照組斑馬魚胚胎48hpf時開始出膜,胚胎發(fā)育到60hpf時,80%的胚胎均已正常孵化出膜,84hpf時,所有對照組胚胎均已孵化出膜,胚胎孵化率為100%.與對照組相比,DMSO單一暴露組、0.1%(DMSO+甲苯)助溶劑復(fù)合物暴露組的斑馬魚胚胎總孵化率均無顯著差異,0.05%甲苯暴露組的胚胎孵化率為92%,但各暴露組斑馬魚胚胎在60hpf和84hpf時的孵化率均顯著低于對照組,說明DMSO和甲苯均可阻礙斑馬魚正常胚胎發(fā)育.另外,與對照組以及甲苯、DMSO單一暴露組相比,0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)助溶劑復(fù)合物暴露組的胚胎孵化率顯著降低,暴露到108hpf時,0.5%(DMSO+甲苯)暴露組的胚胎孵化率僅為37%.上述結(jié)果說明,DMSO和甲苯對斑馬魚胚胎發(fā)育存在明顯的復(fù)合毒性效應(yīng),隨著助溶劑復(fù)合物中DMSO比例的增加,DMSO和甲苯復(fù)合物可顯著降低斑馬魚胚胎孵化率并造成大量斑馬魚胚胎死亡.在實驗過程中,我們還發(fā)現(xiàn)甲苯以及甲苯和DMSO復(fù)合物可造成斑馬魚胚胎發(fā)育遲緩并造成大量的畸形.如圖2所示,與對照組(圖2A、C)相比,0.05%甲苯、0.1%(DMSO+甲苯)、0.3%(DMSO+甲苯)和0.5%(DMSO+甲苯)實驗組的斑馬魚胚胎均出現(xiàn)不同程度的發(fā)育停滯(圖2B),并可觀察到心包、卵黃水腫(圖2D、E)、尾巴彎曲(圖2F)等畸形現(xiàn)象.甲苯、DMSO阻礙斑馬魚胚胎發(fā)育并造成斑馬魚胚胎發(fā)育畸形的具體數(shù)據(jù)如表1所列.與DMSO、甲苯復(fù)合物對斑馬魚胚胎孵化率、死亡率的結(jié)果相同,隨著助溶劑復(fù)合物中DMSO比例的增加,DMSO、甲苯復(fù)合物可顯著阻滯斑馬魚胚胎的正常發(fā)育,并造成大量的胚胎畸形.甲苯以及甲苯和DMSO復(fù)合物對斑馬魚胚胎發(fā)育的毒性結(jié)果表明,低劑量的甲苯(0.05%)單一暴露對斑馬魚胚胎具有較小毒性,但甲苯與DMSO混合物對斑馬魚胚胎具有很強的復(fù)合毒性效應(yīng).甲苯的神經(jīng)毒性效應(yīng)主要表現(xiàn)為抑制生物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶活性,并干擾神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育,但其急性毒性較低,大鼠經(jīng)口LD2.2甲苯和dmso復(fù)合暴露對體外培養(yǎng)細胞活力的影響甲苯和DMSO對人胚腎HEK-293細胞和人胃癌SGC-7901細胞的活力影響如圖3所示.與斑馬魚胚胎發(fā)育毒性實驗結(jié)果不同的是,甲苯和DMSO單一、復(fù)合暴露24h和48h后,對人胚腎HEK-293細胞和人胃癌SGC-7901細胞的活力均未造成顯著影響,這說明甲苯以及甲苯、DMSO復(fù)合物對體外培養(yǎng)的細胞株沒有明顯的毒性效應(yīng).甲苯作為一種脂溶性的毒物,主要作用位點是神經(jīng)系統(tǒng),對神經(jīng)細胞如海馬細胞等具有一定的毒性效應(yīng),但對其它種類的細胞株影響較小3助溶劑對dmso和甲苯毒性效應(yīng)的模擬實驗結(jié)果證實DMSO可通過增加甲苯在水中的分散性,顯著提高低濃度甲苯(0.05%)對斑馬魚胚胎的毒性效應(yīng),DMSO和甲苯存在明顯的復(fù)合毒性效應(yīng).利用離體實驗?zāi)Ｐ驮u估D