Agela液相色譜技術(shù)介紹色譜柱使用

提高分離度R，需要分別增大n，α，k值n：柱效，易受柱長(zhǎng)、填料粒徑的影響α：選擇性，易受流動(dòng)相和固定相影響；k：保留因子，受固定相和流動(dòng)相的影響色譜分離基本方程HPLC柱的“色品”表達(dá)式第1頁(yè)/共49頁(yè)柱效（n）對(duì)分離度（R）的影響以上兩張譜圖k,α值完全相同，僅僅由于柱效高低不同使得它們具有不同的分離度?！案吒粠洝钡?頁(yè)/共49頁(yè)分離選擇性（α）對(duì)分離度（R）的影響

α=1.04α

=1.35α

=1.50

改變分離選擇性α的方法改變固定相改變流動(dòng)相pH值改用不同的流動(dòng)相

改變柱溫第3頁(yè)/共49頁(yè)容量因子（k）對(duì)分離度（R）的影響容量因子大于10，k/(k+1)的改變不大，而分析時(shí)間將大大延長(zhǎng)。因此，k的最佳范圍是1<k<20。改變?nèi)萘恳蜃拥姆椒ㄓ校簻p小柱死體積改變柱溫改變流動(dòng)相的配比梯度洗脫第4頁(yè)/共49頁(yè)αk'N如何控制分辨率?第5頁(yè)/共49頁(yè)

影響色譜柱性能的因素6色譜柱與色譜填料的特性1、柱填料

硅膠純度粒徑（及粒徑分布）比表面積孔徑2、色譜柱的構(gòu)型

色譜柱直徑色譜柱長(zhǎng)度3、固定相鍵合類型殘余硅羥基的影響反相鍵合相的保留行為鍵合硅膠的穩(wěn)定性物理因素化學(xué)因素第6頁(yè)/共49頁(yè)AggregationPolymerization堆砌法硅膠Innoval、UHP、Bonshell

優(yōu)點(diǎn)：高機(jī)械強(qiáng)度，耐污染共聚法硅膠Venusil、Durashell優(yōu)點(diǎn)：分離效果佳

硅膠制作工藝第7頁(yè)/共49頁(yè)硅膠基質(zhì)反相色譜分離三要素固定相流動(dòng)相反相作用氫鍵作用弱離子交換作用反相作用氫鍵作用弱離子交換作用-R-OH-O-H+甲醇/乙腈水緩沖鹽溶液目標(biāo)物A、B疏水部分（鏈烴和芳香烴）羥基、氨基離子化基團(tuán)第8頁(yè)/共49頁(yè)109876543210pHk’2486弱堿弱酸pH=pKORCOHORCOpH對(duì)分離的重要影響調(diào)節(jié)ph值對(duì)樣品的分離非常有效第9頁(yè)/共49頁(yè)色譜柱固定相穩(wěn)定性400-6068-099第10頁(yè)/共49頁(yè)400-6068-099Agela色譜柱最佳pH適用范圍第11頁(yè)/共49頁(yè)中等pH下使用C18

VenusilMPC18(2),孔徑110?

特點(diǎn)：親水性、通用性、

良好分離能力

第12頁(yè)/共49頁(yè)雙層表面處理技術(shù)減低硅膠表面硅羥基的活性第13頁(yè)/共49頁(yè)中等pH下良好的分離能力色譜柱：C18，5μm，4.6×250mm，樣品：?jiǎn)岱?、可待因，脫氫嗎啡的分離，流動(dòng)相:乙腈-25mM乙酸鈉緩沖液（

pH3.5）=10：90，色譜柱A，硅羥基pH=3.5流動(dòng)相pH=3.5，未能抑制硅羥基的活性二次保留嚴(yán)重VenusilMPC18（2），硅羥基pH=5.2流動(dòng)相pH=3.5，能充分抑制硅羥基的活性抑制了二次保留效應(yīng)400-6068-099第14頁(yè)/共49頁(yè)100%水流動(dòng)相的兼容性

樣品：尿苷

色譜柱：4.6*150mm,5μm

流動(dòng)相：100%水

流速：1mL/min

溫度：30℃第15頁(yè)/共49頁(yè)MPC18(2)pH2.6MPC18(2)pH5.8AtlantisT3pH2.6AtlantisT3pH5.8堿性化合物阿米替林在不同pH下保留時(shí)間的變化第16頁(yè)/共49頁(yè)YMCODS-AQpH2.6YMCODS-AQpH5.8HydroRPpH5.8HydroRPpH2.6第17頁(yè)/共49頁(yè)中等PH值范圍，堿性化合物沒(méi)有三乙胺添加劑也可提供更好的峰型第18頁(yè)/共49頁(yè)耐污染，高壽命，高耐受性的XBPC18

(L)孔徑：150?雜質(zhì)不易進(jìn)入空隙而強(qiáng)保留表面積減小，減小極性小物質(zhì)的保留時(shí)間色譜柱：5μm，4.6×250mm；樣品：蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃甲醚；流動(dòng)相：甲醇:0.1%磷酸=80:20；波長(zhǎng)：254nm；柱溫：室溫；流速：1.0mL/min第19頁(yè)/共49頁(yè)高pH值流動(dòng)相優(yōu)勢(shì)流動(dòng)相pH對(duì)RPC保留的影響與樣品類型（酸、堿、中性）的關(guān)系色譜柱：4.6*250mm，5μm，C18，流動(dòng)相：0.025M磷酸鹽、40%甲醇；樣品：1水楊酸；2苯巴比妥；3非那西??；4尼古丁；5甲基丙苯丙胺400-6068-099第20頁(yè)/共49頁(yè)核心技術(shù)-表面雜化技術(shù)寬泛的pH使用范圍(2.0-12.0)

低硅羥基活性

高pH下?lián)碛辛己玫膲勖?/p>

對(duì)堿性化合物有很大的載樣量，適用于制備Durashell液相色譜柱：

DurashellC18，C18(L)，C8第21頁(yè)/共49頁(yè)高pH條件首選

老化條件流動(dòng)相：甲醇:pH=12三乙胺溶液=40:60流速：1.0ml/min;柱溫：40℃;色譜柱：4.6×150；5μm；200?測(cè)試條件流動(dòng)相：甲醇:水=85:15流速：0.8ml/min檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：1μL色譜柱：4.6×150；5μm；200?樣品：尿嘧啶、苯酚、硝基苯、萘250h后初始：0h第22頁(yè)/共49頁(yè)強(qiáng)酸下使用的ASBC18色譜柱R=異丙基，防止鍵合相流失

優(yōu)勢(shì)

適用于pH0.8-4的流動(dòng)相使得對(duì)pH較敏感的分離得到優(yōu)化極低pH有較好的柱效和使用壽命第23頁(yè)/共49頁(yè)酸性條件下的良好壽命第24頁(yè)/共49頁(yè)酸性條件分離酸性物質(zhì)第25頁(yè)/共49頁(yè)

親水作用液相色譜柱

VenusilHILIC第26頁(yè)/共49頁(yè)與被分析物極性基團(tuán)相互作用：增加極性化合物的保留與硅膠表面殘余硅羥基相互作用：改善拖尾，改善極性化合物的峰型，提高分離效率；分離機(jī)理反相液相色譜（RPLC）是最廣的色譜分離技術(shù)，可解決多種分析應(yīng)用問(wèn)題，但對(duì)某些分析物，特別是極性和親水性化合物卻無(wú)法或很少保留。長(zhǎng)期以來(lái)，人們采用正相液相色譜(NPLC)，并使用不利環(huán)保的非水溶性流動(dòng)相如己脘或環(huán)己脘來(lái)分析這些物質(zhì)。但是在這種實(shí)驗(yàn)條件下，很多極性和親水化合物往往很難溶解，從而限制了NPLC的應(yīng)用范圍。從現(xiàn)在起有了另一種新的解決辦法，即選用親水作用液相色譜-HILIC。第27頁(yè)/共49頁(yè)VenusilHILIC色譜柱：益母草中鹽酸水蘇堿的測(cè)定（中國(guó)藥典2010版修訂品種）對(duì)照品：理論板數(shù)（22757）、對(duì)稱性（0.94）供試品：理論板數(shù)（17400）、對(duì)稱性（0.80）色譜柱：VenusilHILIC柱(丙基酰胺鍵合硅膠)，100?，4.6×250mm，5μm流動(dòng)相：乙腈-0.2％冰醋酸溶液（80:20）；流速：0.5ml/min檢測(cè)：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ELSD）；進(jìn)樣量：20μl；柱溫：20℃鹽酸水蘇堿第28頁(yè)/共49頁(yè)葡萄糖分析流動(dòng)相：乙腈－水（80∶20）流速：1ml/min柱溫：30℃檢測(cè)器：蒸發(fā)光散射檢測(cè)器α-D-葡萄糖β-D-葡萄糖氨基柱：氨丙基鍵合硅膠VenusilHILC：丙基酰胺鍵合硅膠第29頁(yè)/共49頁(yè)分離水溶性維生素Time樣品:VB1,VB6,VC,VB2色譜柱:VenusilHILIC4.6x150mm,5um流動(dòng)相:0.1%TFA:ACN=90:10流速:1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):280nm;Temp:30℃；第30頁(yè)/共49頁(yè)地西他濱和雜質(zhì)的分離色譜柱:VenusilHILIC4.6×150mm,5μm，流動(dòng)相:ACN:H2O＝96:4;1ml/min;UV:244nm;roomtemp第31頁(yè)/共49頁(yè)Agela極其豐富的鍵合相各種專用柱（阿奇霉素專用柱、左卡尼丁專用柱、糖柱…）定制色譜柱（期待與您合作，開(kāi)發(fā)屬于您的專用柱）第32頁(yè)/共49頁(yè)

超高效液相色譜技術(shù)——

UHPLC色譜柱/Core-shell色譜柱第33頁(yè)/共49頁(yè)UHPLC色譜柱1.9μm粒徑：比1.7μm壓力低，耐污染耐壓800bar鍵合相：UHPASBC18UHPAQC18UHPC18第34頁(yè)/共49頁(yè)Bonshell填料技術(shù)

內(nèi)部為1.7um實(shí)心球外部為0.5um多孔外殼耐污染:粒徑大同時(shí)物質(zhì)不會(huì)進(jìn)入硅膠實(shí)心球內(nèi)部造成堵塞，較全多孔顆粒壽命更長(zhǎng)。耐高壓:1.7um實(shí)心球較普通3um硅膠更高的耐壓性，耐壓到800bar(12000psi),為高流速分離提供支持。第35頁(yè)/共49頁(yè)填料粒徑對(duì)色譜柱柱效的影響第36頁(yè)/共49頁(yè)保持與1.9μm色譜柱相同分離速度和效果，卻維持較低的系統(tǒng)壓力第37頁(yè)/共49頁(yè)Bonshell-縮短了保留時(shí)間樣品:太古霉素5μm傳統(tǒng)C18,流速:1.0mL/min2.7μmBonshellASBC18流速:2.5mL/min第38頁(yè)/共49頁(yè)流動(dòng)相:乙腈:1%甲酸=32:68UV:254nm流速:1.0mL/min.30°C進(jìn)樣量:5μL響應(yīng)時(shí)間:4.0秒響應(yīng)時(shí)間:2.0秒響應(yīng)時(shí)間:1.0秒響應(yīng)時(shí)間:0.5秒響應(yīng)時(shí)間:0.1秒尿嘧啶乙酰水楊酸N-乙酰苯胺UracilAcetylsalicylicacidAcetanilide縮短檢測(cè)器響應(yīng)時(shí)間，可增加柱效（提高靈敏度）檢測(cè)器的響應(yīng)時(shí)間對(duì)分離度的影響在UHPLC上值得重視第39頁(yè)/共49頁(yè)HPLC色譜柱的日常保養(yǎng)與維護(hù)

第40頁(yè)/共49頁(yè)新HPLC色譜柱的使用查看說(shuō)明書，確定新色譜柱的保存溶劑(氨基柱，HILIC等)確定與檢測(cè)所需流動(dòng)相是否互溶使用互溶溶劑過(guò)渡，正反相溶劑過(guò)渡使用異丙醇流動(dòng)相含有鹽使用90%甲醇水過(guò)渡使用檢測(cè)流動(dòng)相平衡色譜柱10-20倍柱體積色譜柱使用后的保存溶劑（正相建議同說(shuō)明書，反相純乙腈或純甲醇）強(qiáng)烈建議進(jìn)行色譜柱使用分類（由樣品類型來(lái)歸類）第41頁(yè)/共49頁(yè)色譜柱不銹鋼毛細(xì)管接頭如果伸出的管線長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，可能漏液

螺母坡度不匹配，密封性差

死體積區(qū)如果伸出的管線長(zhǎng)度不夠，可能產(chǎn)生死體積第42頁(yè)/共49頁(yè)0.13mm內(nèi)徑(紅)用于毛細(xì)管HPLC中<2.1內(nèi)徑色譜柱0.18mm內(nèi)徑(黃)用于分析型HPLC中2.1~4.6內(nèi)徑色譜柱0.25mm內(nèi)徑(藍(lán))用于半制備型HPLC中10.0內(nèi)徑色譜柱0.5mm內(nèi)徑(橙)用于制備型HPLC中21.2內(nèi)徑色譜柱PEEK連接管線與接頭色譜柱:4.6x30mm,3.5mm流動(dòng)相:85%H2Owith0.1%三氟乙酸:15%ACN流速:1.0mL/min溫度:35°C50

mL柱外體積（管線）4321Time(min)0.00.51.01.52.010mL柱外體積Time(min)0.00.51.01.52.04321樣品:1.苯丙胺酸2.5-苯基-3,6-二氧-2-哌嗪乙酸3.Asp-Phe4.天冬甜素第43頁(yè)/共49頁(yè)色譜柱柱內(nèi)體積和平衡時(shí)間

4.6x50 0.5mL 5min 4.6x150 1.5mL 15min 4.6x250 2.5mL 25min

2.1x30 0.06mL 3min 36sec 2.1x50 0.10mL 5min 60sec 2.1x100 0.20mL 10min 120sec

色譜柱 柱內(nèi)平衡時(shí)間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)1.0mL/min

色譜柱 柱內(nèi)平衡時(shí)間 尺寸 體積流速

(mm) (Vm)0.2mL/min1.0mL/min第44頁(yè)/共49頁(yè)顆粒物堵塞篩板引起柱壓上升顆粒物來(lái)源：樣品→離心，過(guò)0.45μm或0.22μm濾膜，注意濾膜性質(zhì)泵和進(jìn)樣閥密封圈磨損→更換配置流動(dòng)相→過(guò)0.45μm或0.22μm濾膜，注意濾膜性質(zhì)緩沖鹽析出→注意梯度運(yùn)行和進(jìn)樣時(shí)鹽的溶劑環(huán)境改變，甲醇對(duì)緩沖鹽溶