提取與沉淀分離技術(shù)

用于生物化學(xué)大分子研究的獨(dú)特的分析、制備技術(shù)生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的主要特點(diǎn)是：①操作溫和，使對(duì)所研究組分的天然結(jié)構(gòu)和功能的損害，盡可能減少至最小。②微量分析，低達(dá)ng或pg水平；或大量分離制備，高達(dá)公斤級(jí)。③分辨率高，可明確區(qū)分結(jié)構(gòu)或性質(zhì)極其相似的物質(zhì)。

現(xiàn)代生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，按其目的和性質(zhì)分為三大類。

一、按不同的物理化學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析鑒定和分離制備，其中又可分為五類

①根據(jù)分子的大小進(jìn)行分辨者，有凝膠過濾法、超速離心法、超濾法、SDS電泳分析等。②根據(jù)分子荷電情況進(jìn)行分辨者，有等電聚焦電泳法、離子交換層析法等。③根據(jù)吸收光譜和放射性等性質(zhì)進(jìn)行分辨者,有紫外/紅外/熒光分光光度法、X射線結(jié)構(gòu)分析法、電子順磁共振,電子自旋共振和核磁共振法,以及放射性核素示蹤和放射免疫分析法等。④根據(jù)疏水相互作用或氫鍵形成的引力進(jìn)行分辨者，有反相高效液相層析、分子雜交技術(shù)等。⑤根據(jù)特異相互作用進(jìn)行分辨者，有親和層析、免疫化學(xué)分析法等。

二、經(jīng)一系列不同的化學(xué)和物理方法處理，以求得差異分辨，或按指令合成不同的高分子物質(zhì)。如氨基酸序列分析和序列合成、核苷酸序列分析和序列合成等。三、有目的地對(duì)DNA進(jìn)行剪切拼接，引入細(xì)胞中的（或分子克隆技術(shù)）等。

細(xì)胞破碎定義

從含有多種組分的混合物中將某種生化物質(zhì)與其他物質(zhì)分離的技術(shù)目的縮短整個(gè)下游過程的流程和提高單項(xiàng)操作的效率

新趨勢——高效集成化

1繼續(xù)研究和完善一些適用于生化工程的新型分離技術(shù)；2進(jìn)行各種分離技術(shù)的高效集成化。第一篇生化分離技術(shù)定義采用一定的方法，在一定程度上破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，設(shè)法使胞內(nèi)產(chǎn)物最大程度地釋放到液相中，破碎后的細(xì)胞漿液經(jīng)固液分離除去細(xì)胞碎片后，再采用不同的分離手段進(jìn)一步純化.第一章提取與沉淀分離技術(shù)第一節(jié)細(xì)胞破碎細(xì)胞壁的組成和結(jié)構(gòu)微生物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)細(xì)菌：肽聚糖的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)酵母菌：葡聚糖，甘露聚糖，蛋白質(zhì)真菌：細(xì)胞壁更厚植物細(xì)胞壁的化學(xué)組成和結(jié)構(gòu)初生壁，次生壁具有很高的機(jī)械強(qiáng)度細(xì)胞破碎技術(shù)一機(jī)械破碎法

通過機(jī)械運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生的剪切力作用使細(xì)胞破碎的方法。分為搗碎法、研磨法和勻漿法1.1搗碎法利用搗碎機(jī)的高速旋轉(zhuǎn)葉片產(chǎn)生的剪切力將組織細(xì)胞破碎。如葉綠體的分離常用于動(dòng)物內(nèi)臟、植物葉片等較脆嫩的組織細(xì)胞；微生物細(xì)胞破碎也可以使用1.2勻漿法影響勻漿破碎的主要因素是壓力、溫度和通過勻漿器閥的次數(shù)。高壓勻漿法的適用范圍較廣，在微生物細(xì)胞和植物細(xì)胞的大規(guī)模處理中常采用.高速珠磨機(jī)研磨是常用的一種方法，它將細(xì)胞懸浮液與玻璃小珠、石英砂或氧化鋁等研磨劑一起快速攪拌，使細(xì)胞獲得破碎。在工業(yè)規(guī)模的破碎中常采用高速珠磨機(jī)1.3研磨法2.1反復(fù)凍溶法原理：反復(fù)凍融過程中，由于滲透壓的變化，使結(jié)合水凍結(jié)產(chǎn)生組織的變性，冰片將細(xì)胞膜破碎，使蛋白質(zhì)可溶化，成為黏稠的濃溶液，但脂蛋白凍結(jié)變性。方法：將待破碎的細(xì)胞于冷藏庫或干冰反復(fù)于零下15-20℃使之凝固，然后緩慢地融解，如此反復(fù)操作，使大部分細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)顆粒破壞。

特點(diǎn)：此法適用于組織細(xì)胞，多用于動(dòng)物性材料，對(duì)微生物細(xì)胞作用較差。

二物理破碎法物理法破碎細(xì)胞主要通過各種物理因素使組織細(xì)胞破碎。將材料投入沸水中，維持90℃左右維持?jǐn)?shù)分鐘，立即置于冰水浴中使之迅速冷卻，絕大部分細(xì)胞被破壞。2.2冷熱更替法2.3壓力差破碎法通過壓力的突然變化，使細(xì)胞破碎。高壓沖擊法、突然降壓法、滲透壓變化法用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料，用大腸桿菌制備各種酶，常選用50-100毫克菌體/毫升濃度，頻高于15～20KHz的超聲波在高強(qiáng)度聲能輸入下可以進(jìn)行細(xì)胞破碎。

破碎機(jī)理：可能與空化現(xiàn)象引起的沖擊波和剪切力有關(guān)。超聲破碎的效率與聲頻、聲能、處理時(shí)間、細(xì)胞濃度及首種類型等因素有關(guān)。

2.4超聲波處理

存在問題：超聲波破碎在實(shí)驗(yàn)室規(guī)模應(yīng)用較普遍，處理少量樣品時(shí)操作簡便，液量損失少，但是超聲波產(chǎn)生的化學(xué)自由基團(tuán)能使某些敏感性活性物質(zhì)變性失活。

而且大容量裝置聲能傳遞，散熱均有困難，應(yīng)采取相應(yīng)降溫措施。對(duì)超聲波敏感和核酸應(yīng)慎用。空化作用是細(xì)胞破壞的直接原因，同時(shí)會(huì)產(chǎn)生活性氧，所以要加一些巰基保護(hù)劑。特點(diǎn)：操作簡單，重復(fù)性較好，節(jié)省時(shí)間；多用于微生物和組織細(xì)胞的破碎。三化學(xué)破碎法某些有機(jī)溶劑（如苯、甲苯）、抗生素、表面活性劑、金屬螯合劑、變性劑等化學(xué)藥品都可以改變細(xì)胞壁或膜的通透性從而使內(nèi)合物有選擇地滲透出來。

作用機(jī)理：化學(xué)滲透取決于化學(xué)試劑的類型以及細(xì)胞壁和膜的結(jié)構(gòu)與組成。

特點(diǎn)：多用于破碎細(xì)菌，且作用比較溫和；提取核酸時(shí)，常用此法破碎細(xì)胞。

存在的問題：時(shí)間長，效率低；化學(xué)試劑毒性較強(qiáng)，同時(shí)對(duì)產(chǎn)物也有毒害作用，進(jìn)一步分離時(shí)需要用透析等方法除去這些試劑；通用性差：某種試劑只能作用于某些特定類型的微生物細(xì)胞。四酶促破碎法利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶、半纖維素酶、脂酶等，將細(xì)胞壁分解，使細(xì)胞內(nèi)含物釋放出來。有些細(xì)菌對(duì)溶菌酶不敏感，加入少量巰基試劑或8mol/L尿素處理后，使之轉(zhuǎn)為對(duì)溶菌酶敏感而溶解。存在的問題：易造成產(chǎn)物抑制作用，這可能是導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)釋放率低的一個(gè)重要因素。而且溶酶價(jià)格高，限制了大規(guī)模利用。若回收溶酶，則又增加分離純化溶酶的操作。另外酶溶法通用性差，不同菌種需選擇不同的酶。有一定局限性，不適宜大量的蛋白質(zhì)提取，給進(jìn)一步純化帶來困難。特點(diǎn)：

a、此法適用多種微生物；

b、具有作用條件溫和；

c、內(nèi)含物成分不易受到破壞；

d、細(xì)胞壁損壞的程度可以控制

五選擇破碎方法的依據(jù)(1)細(xì)胞的處理量(2)細(xì)胞壁的強(qiáng)度和結(jié)構(gòu)(3)目標(biāo)產(chǎn)物對(duì)破碎條件的敏感性(4)破碎程度適宜的操作條件應(yīng)從高的產(chǎn)物釋放率，低的能耗和便于后步提取這二方面進(jìn)行權(quán)衡六破碎技術(shù)研究的方向(1)多種破碎法的結(jié)合(2)與上游技術(shù)結(jié)合(3)與下游操作技術(shù)結(jié)合第二節(jié)提取定義：一定條件下，用適當(dāng)?shù)娜軇ㄈ芤海┨幚碓鲜褂蛛x物質(zhì)充分溶解到溶劑（溶液）中的過程。也稱為抽提。一提取方法1.1鹽溶液提取鹽溶/鹽析：低鹽下，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度的升高而增加/鹽濃度達(dá)到某一界限后，蛋白質(zhì)溶解度隨鹽濃度升高而下降。低鹽—蛋白質(zhì)提取—0.02-0.5mol/L高鹽—蛋白質(zhì)沉淀1.2酸溶液提取酸性條件下，溶解度大、穩(wěn)定的物質(zhì)使用PH不能太低，以免失活；一般PH3-61.3堿溶液提取堿性條件下，溶解度大、穩(wěn)定的物質(zhì)使用PH不能過高，以免影響酶活性；1.4有機(jī)溶劑提取與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團(tuán)的蛋白質(zhì)，采取與水可以混溶的乙醇、丙酮等有機(jī)溶劑提??；

DNA和RNA可以采用苯酚水溶液提?。?/p>

DNA、蛋白質(zhì)-苯酚層

RNA、多糖-水層二影響因素

2.1溶解度相似者相溶，物質(zhì)極性、溫度、PH2.2擴(kuò)散速度溫度、溶液黏度、擴(kuò)散面積、擴(kuò)散距離、兩相濃度差2.3提取液體積提取液總量一般為原料體積的3-5倍第三節(jié)沉淀分離定義：經(jīng)沉淀反應(yīng)使不同組分相互分離的方法一般做法是控制適當(dāng)?shù)膒H值，加入沉淀劑使少數(shù)幾種組分首先沉淀，過濾分離后重新調(diào)節(jié)pH值，加入另種沉淀劑使另外少數(shù)幾種組分生成沉淀。如此依次沉淀和分離后，可將復(fù)雜試樣中的各組分分成若干組，使得復(fù)雜的分析問題變得較簡單。鹽析/有機(jī)溶劑沉析/等電點(diǎn)沉析/有機(jī)聚合物沉析/其他沉析技術(shù)一鹽析原理溶液加入高濃度中性鹽后，鹽離子與生物分子表面的帶相反電荷的離子基團(tuán)結(jié)合，中和了生物分子表面的電荷，降低了生物分子與水分子之間的相互作用，生物分子表面水化膜逐漸被破壞，當(dāng)鹽濃度達(dá)到一定的限度時(shí)，生物分子之間的排斥力降到很小，此時(shí)生物分子很容易相互聚集，在溶液中的溶解度降得很低，從而形成沉淀從溶液中析出。產(chǎn)生鹽析的另一個(gè)原因是大量鹽離子自身的水合作用降低了自由水的濃度，使生物分子脫去了水化膜，暴露出疏水區(qū)域，由于疏水區(qū)域的相互作用，使其沉淀析出。

影響鹽析的因素（一）鹽離子濃度在低鹽濃度時(shí)，鹽離子能增加生物分子表面電荷，使生物分子水合作用增強(qiáng)，具有促進(jìn)溶解的作用，稱鹽溶現(xiàn)象。當(dāng)鹽濃度達(dá)一定值后,鹽濃度升高，生物分子溶解度不斷降低,產(chǎn)生了鹽析作用,不同的生物分子，“鹽溶”與“鹽析”的分界值不同。

（二）生物分子種類生物分子的分子結(jié)構(gòu)不同，其分子表面親水基團(tuán)與疏水基團(tuán)不相同，不同生物分子產(chǎn)生鹽析現(xiàn)象所需中性鹽的濃度（離子強(qiáng)度）亦不同。（三）生物分子濃度溶液中生物分子的濃度對(duì)鹽析的效果有很大的影響，要得到理想的沉析效果，必須將生物分子的濃度控制在一定的范圍內(nèi)。一般對(duì)于蛋白質(zhì)溶液，其濃度為2%～3%比較合適。（四）pH值在鹽析時(shí)，如果要沉析某一成分，應(yīng)將溶液的pH值調(diào)整到該成分的等電點(diǎn)，如果希望某一成分保留在溶液中不析出，則應(yīng)使溶液的pH值偏離該成分的等電點(diǎn)。（五）溫度多數(shù)物質(zhì)的溶解度會(huì)受溫度變化的影響。

鹽析的操作與應(yīng)用（一）鹽析的操作1、鹽的處理硫酸銨使用時(shí)要求純度較高，生產(chǎn)時(shí)為降低成本，一般選用化學(xué)純的硫酸銨，在使用前應(yīng)進(jìn)行預(yù)處理，可通過化學(xué)法將重金屬除去（如通入H2S后過濾），再將硫酸銨重結(jié)晶備用。2、加鹽的方法（1）直接加入固體硫酸銨法（2）加入飽和硫酸銨溶液法3、鹽析操作注意事項(xiàng)（1）鹽析反應(yīng)完全需要一定時(shí)間，一般硫酸銨全部加完后，應(yīng)放置30min以上才可進(jìn)行固-液分離。（2）經(jīng)過一次分級(jí)得到的鹽析沉淀，能否進(jìn)行第二次鹽析要靠試驗(yàn)確定。（3）鹽析操作時(shí)加入鹽的純度、加量、加入方法、攪拌的速度、溫度及pH等參數(shù)應(yīng)嚴(yán)格控制。

（4）鹽析時(shí)生物分子濃度要合適，應(yīng)充分考慮共沉及稀釋后收率、鹽量和固-液分離等問題。一般低濃度硫酸銨可采用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法，因?yàn)楦邼舛攘蛩徜@密度太大，要使蛋白質(zhì)完全沉降下來需要較高的離心速率和較長的離心時(shí)間。

（5）鹽析后溶液應(yīng)進(jìn)行脫鹽，常用的辦法有透析、凝膠過濾及超濾等。

（二）鹽析的主要應(yīng)用

鹽析是最早使用的生化分離技術(shù)之一，由于易產(chǎn)生共沉作用，故其分辨率不是很高，但配其他手段完全能達(dá)到很好的分離效果。由于成本低，操作安全簡單，對(duì)許多生物活性物質(zhì)具有很好的穩(wěn)定作用，常用于蛋白質(zhì)、酶、多肽、多糖、核酸等物質(zhì)的分離純化。

二等電點(diǎn)沉析等電點(diǎn)沉析原理調(diào)節(jié)兩性生化物質(zhì)溶液的pH值，以達(dá)到某一生化物質(zhì)的等電點(diǎn)，使其從溶液中沉淀析出而實(shí)現(xiàn)分離的技術(shù)稱為等電點(diǎn)沉析技術(shù)。等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低

等電點(diǎn)沉析的注意事項(xiàng)（一）等電點(diǎn)的改變（二）目的物的穩(wěn)定性（三）鹽溶作用（四）pH的調(diào)節(jié)

等電點(diǎn)沉析的應(yīng)用（一）在生化產(chǎn)品的分離純化過程中，常利用兩性物質(zhì)如氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽、酶、核酸等具有不同的等電點(diǎn)的特性來進(jìn)行產(chǎn)品的分離純化。（二）等電點(diǎn)沉析只適用于水化程度不大，在等電點(diǎn)時(shí)溶解度很低的物質(zhì)，如四環(huán)素等在等電點(diǎn)(pH=5.4)附近,難溶于水，能產(chǎn)生沉析。

三有機(jī)溶劑沉析原理（一）親水性有機(jī)溶劑本身的水合作用降低了自由水的濃度，使溶質(zhì)分子周圍的水化層變薄，導(dǎo)致脫水而相互聚集析出，也就是降低了溶質(zhì)的溶解度。（二）有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，加入有機(jī)溶劑后，整個(gè)溶液的介電常數(shù)降低，帶電的溶質(zhì)分子之間庫侖引力增強(qiáng)，使溶質(zhì)分子相互吸引而聚集。

影響有機(jī)溶劑沉析的因素（一）溫度大多數(shù)生物大分子如蛋白質(zhì)、酶和核酸在有機(jī)溶劑中對(duì)溫度特別敏感，溫度稍高就會(huì)引起變性，且有機(jī)溶劑與水混合時(shí)產(chǎn)生放熱反應(yīng)，因此有機(jī)溶劑必須預(yù)先冷至較低溫度，一般在0℃以下，操作時(shí)要在冰鹽浴中進(jìn)行，加入有機(jī)溶劑必須緩慢，并不斷攪拌以免局部濃度過濃。溫度越低，得到的生物活性物質(zhì)越多，而且可以減少有機(jī)溶劑的揮發(fā)。（二）生物樣品的濃度

與鹽析相似，樣品濃度低時(shí)增加有機(jī)溶劑投入量和損耗，降低了溶質(zhì)回收率，易產(chǎn)生稀釋變性，但共沉的作用小，有利于提高分離效果。反之，對(duì)于高濃度的生物樣品，節(jié)省了有機(jī)溶劑，減少了變性的危險(xiǎn)，但共沉作用大，分離效果下降。一般認(rèn)為，對(duì)于蛋白質(zhì)溶液0.5%-2%起始濃度較合適,對(duì)于粘多糖以1%-2%為起始濃度為宜。（三）pH有機(jī)溶劑沉析時(shí)適宜的pH，要選擇在樣品穩(wěn)定的pH范圍內(nèi)，而且盡可能選擇樣品溶解度最低的pH，通常是選在等電點(diǎn)附近，以提高該沉析的分辨能力。但應(yīng)注意的是有少數(shù)生物分子在等電點(diǎn)附近不穩(wěn)定，影響其活性；同時(shí)盡量避免目的物與雜質(zhì)帶相反電荷而加劇共沉現(xiàn)象的發(fā)生。（四）離子強(qiáng)度在有機(jī)溶劑和水的混合液中，當(dāng)離子強(qiáng)度很小，物質(zhì)不能沉析時(shí)，補(bǔ)加少量電解質(zhì)即可解決。鹽的濃度太大(0.1-0.2mol／L以上)，就需大量的有機(jī)溶劑來沉析，并可能使部分鹽在加入有機(jī)溶劑后析出。同時(shí)鹽的離子強(qiáng)度達(dá)一定程度時(shí)，還會(huì)增加蛋白質(zhì)或酶在有機(jī)溶劑中的溶解度。所以一般離子強(qiáng)度在0.05或稍低為好，既能使沉析迅速形成，又能對(duì)蛋白質(zhì)或酶起一定的保護(hù)作用，防止變性。（五）金屬離子在用有機(jī)溶劑沉析生物高分子時(shí)還應(yīng)注意到某些金屬離子的助沉作用，一些金屬離子如Zn2+、Ca2+等可與某些呈陰離子狀態(tài)的生物高分子形成復(fù)合物。這種復(fù)合物的溶解度大大降低而不影響生物活性，有利于沉析形成，并降低有機(jī)溶劑的耗量，0.005-0.02mol／L的Zn2+可使有機(jī)溶劑用量減少l／3至1／2,使用時(shí)要避免會(huì)與這些金屬離子形成難溶鹽的陰離子(如磷酸根)的存在。

有機(jī)溶劑沉析的應(yīng)用（一）有機(jī)溶劑沉析的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：分辨能力比鹽析高,即一種生物分子或其他溶質(zhì)只在一個(gè)比較窄的有機(jī)溶劑濃度范圍內(nèi)沉析；沉析不用脫鹽，過濾比較容易。缺點(diǎn)：是某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進(jìn)行。

（二）應(yīng)用

有機(jī)溶劑沉析技術(shù)經(jīng)常用于蛋白質(zhì)、酶，多糖和核酸等生物大分子的沉析分離。使用時(shí)先要選擇合適的有機(jī)劑，然后注意調(diào)控樣品的濃度、溫度、pH和離子強(qiáng)度，使之達(dá)到最佳的分離效果。沉析所得的