22土壤中分解尿素細菌分離和計數(shù)精校版

02九月20231專題2微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用課題2土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(shù)02九月20232尿素分子的立體結(jié)構(gòu)CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶兩個主要目的：（1）從土壤中分離出能夠分解尿素的細菌；（2）統(tǒng)計每克土壤樣品中究竟含有多少這樣的細菌。02九月20233研究思路美國黃石國家公園的一個熱泉（一）篩選菌株水生耐熱細菌Taq(Thermusaquaticus)耐高溫的TaqDNA聚合酶美國微生物學(xué)科布魯克（T.Brock)1966年發(fā)現(xiàn)耐熱細菌選擇培養(yǎng)基在微生物學(xué)中，將允許特定種類的微生物生長，同時抑制或阻止其他種類微生物生長的培養(yǎng)基。02九月20234（二）統(tǒng)計菌落數(shù)目統(tǒng)計菌落數(shù)目的理論依據(jù)：當樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌。因此，恰當?shù)南♂尪仁浅晒Φ亟y(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵。為了保證結(jié)果準確，通常將幾個稀釋度下的菌液都涂布在平板上，培養(yǎng)后再選擇菌落數(shù)在30～300的平板進行計數(shù)。02九月20235？說明設(shè)置重復(fù)組的重要性。第一位同學(xué)只涂布了一個平板，沒有設(shè)置重復(fù)組，因此結(jié)果不具有說服力。第二位同學(xué)考慮到設(shè)置重復(fù)組的問題，涂布了3個平板，但是，其中1個平板的計數(shù)結(jié)果與另2個相差太遠，說明在操作過程中可能出現(xiàn)了錯誤，因此，不能簡單地將3個平板的計數(shù)值用來求平均值。這個實例啟示學(xué)生，在設(shè)計實驗時，一定要涂布至少3個平板，作為重復(fù)組，才能增強實驗的說服力與準確性。在分析實驗結(jié)果時，一定要考慮所設(shè)置的重復(fù)組的結(jié)果是否一致，結(jié)果不一致，意味著操作有誤，需要重新實驗。02九月20236注意：統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低。這是因為當兩個或多個細胞連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。因此結(jié)果一般用菌落數(shù)而不是用活菌數(shù)來表示。顯微鏡直接計數(shù)也是測定微生物數(shù)量的常用方法。每克樣品中的菌株數(shù)＝（C÷V）×MC：某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)V：涂布平板時所用的稀釋液的體積（ml)M：稀釋倍數(shù)02九月20237（二）設(shè)置對照一是由于土樣不同，二是由于培養(yǎng)基污染或操作失誤。究竟是哪個原因，可以通過實驗來證明。實驗方案有兩種。一種方案是可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進行實驗，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A無誤；如果結(jié)果不同，則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問題。另一種方案是將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進行培養(yǎng)，作為空白對照，以證明培養(yǎng)基是否受到污染。通過這個事例可以看出，實驗結(jié)果要有說服力，對照的設(shè)置是必不可少的。02九月20238實驗設(shè)計[一]土壤取樣從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土3cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中。02九月20239[二]樣品的稀釋為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？測定土壤中細菌的總量和測定土壤中能分解尿素的細菌的數(shù)量，選用的稀釋范圍相同嗎？這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭氧細菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不同的稀釋度進行分離，同時還應(yīng)當有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件。02九月202310[三]微生物的培養(yǎng)與觀察02九月202311操作提示[一]無菌操作1、取土用的小鐵鏟的盛土樣的信封在使用前都需要滅菌。2、應(yīng)在火焰旁稱取土壤。在火焰附近將稱好的土樣倒入錐形瓶中，塞好棉塞。3、在稀釋土壤溶液的過程中，每一步都要在火焰旁操作。[二]做好標記注明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期、平板培養(yǎng)樣品的稀釋度等。[三]規(guī)劃時間02九月202312結(jié)果分析與評價1、結(jié)合對照，分析培養(yǎng)物中是否有雜菌污染以及選擇培養(yǎng)基是否篩選出一些菌落。2、是否獲得了某一稀釋度下，菌落數(shù)目在30——300的平板。在這稀釋度下，是否至少有兩個平板的菌落數(shù)相近？3、你統(tǒng)計的每克土壤中含有能分解尿素的細菌的菌落數(shù)是多少？與其他同學(xué)的結(jié)果接近嗎？如果差異很大，可能是什么原因引起的？02九月202313課題延伸CO（NH2）2+H2O CO2+2NH3脲酶