中國藥典微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案樣本

資料內(nèi)容僅供您學(xué)習(xí)參考，如有不當(dāng)之處，請聯(lián)系改正或者刪除。人工牛黃甲硝唑膠囊微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案起草部門:QC組簽名:日期:審核部門:QC組簽名:日期:部門:質(zhì)量部簽名:日期:批準(zhǔn)質(zhì)量負(fù)責(zé)人簽名:日期:質(zhì)量部頒發(fā)本文件根據(jù)需要應(yīng)分發(fā)于以下部門:01質(zhì)量部下表用于記錄修訂/變更主要內(nèi)容及歷史。文件編號修訂原因修訂日期TS-VP-4201-00按GMP(修訂版)要求新制定.10.22

目錄1.概述2.驗(yàn)證目的和范圍3.組織及職責(zé)4.驗(yàn)證進(jìn)度計(jì)劃表5.驗(yàn)證所需要的儀器設(shè)備及相關(guān)文件的確認(rèn)6.驗(yàn)證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗(yàn)樣品的確認(rèn)7.驗(yàn)證項(xiàng)目和驗(yàn)證方法7.1試驗(yàn)菌株7.2需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證的菌液制備7.3需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證--常規(guī)傾注平皿法7.4需氧菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證—離心沉淀-薄膜過濾法7.5控制菌檢查方法驗(yàn)證—離心沉淀-薄膜過濾法8.偏差與漏項(xiàng)控制9.驗(yàn)證報(bào)告會審

1.概述我公司生產(chǎn)品種人工牛黃甲硝唑膠囊,產(chǎn)品微生物限度檢查項(xiàng)目為需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)、以及大腸埃希菌檢查和沙門菌檢查。參照《中國藥典》四部附錄1105:微生物計(jì)數(shù)法,以及1106:控制菌檢查法的規(guī)定,本公司對該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法予以驗(yàn)證。經(jīng)過驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的微生物限度檢查方法適用。人工牛黃甲硝唑膠囊處方中含有甲硝唑、人工牛黃以及常見輔料成分,文獻(xiàn)資料介紹甲硝唑?qū)?xì)菌有抑菌特性,對霉菌和酵母菌無抑菌活性。甲硝唑在水中微溶,能夠經(jīng)過離心沉淀-薄膜過濾法去除其對微生物生長的影響。本驗(yàn)證方案經(jīng)過試驗(yàn)菌株的回收率測試,首先確認(rèn)常規(guī)傾注平皿法是否適用于本品的微生物限度檢查;如常規(guī)傾注平皿法不適用,則進(jìn)一步驗(yàn)證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的微生物限度檢查。本驗(yàn)證方案根據(jù)樣品特性制定微生物限度檢查方法和檢驗(yàn)條件,按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn),根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。2.驗(yàn)證目的和范圍驗(yàn)證該產(chǎn)品的微生物限度檢查方法的適用性,對其有效性進(jìn)行評價(jià),保證檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本驗(yàn)證方案采用3批按GMP要求組織生產(chǎn)的人工牛黃甲硝唑膠囊,進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證。3.組織及職責(zé)3.1驗(yàn)證方案和驗(yàn)證報(bào)告的起草、審核、批準(zhǔn)驗(yàn)證方案由質(zhì)量部QC組負(fù)責(zé)起草,由質(zhì)量部審核,最終由質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)。驗(yàn)證方案實(shí)施完成后,由QC組負(fù)責(zé)匯總微生物限度檢查法驗(yàn)證的結(jié)果、撰寫報(bào)告,由質(zhì)量部審核,最終由質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)報(bào)告。3.2驗(yàn)證方案的培訓(xùn)驗(yàn)證方案在經(jīng)質(zhì)量負(fù)責(zé)人批準(zhǔn)后,,由QC組組長對本次驗(yàn)證實(shí)施的相關(guān)人員組織培訓(xùn)工作,并將該次的培訓(xùn)記錄歸檔。3.3驗(yàn)證方案實(shí)施過程中的變更和偏差驗(yàn)證方案實(shí)施過程中如有變更和偏差,質(zhì)量負(fù)責(zé)人應(yīng)當(dāng)組織進(jìn)行評估并采取相應(yīng)的控制措施。3.4驗(yàn)證工作小組成員表姓名部門及職務(wù)職責(zé)黃漢新質(zhì)量負(fù)責(zé)人/質(zhì)量受權(quán)人負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的批準(zhǔn)胡建新質(zhì)量部QA組長審核驗(yàn)證方案、審核驗(yàn)證報(bào)告并協(xié)調(diào)工作曾鳳敏質(zhì)量部QC組長負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案審核、實(shí)施、匯總報(bào)告及培訓(xùn)工作劉紅華質(zhì)量部QC負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案起草、具體實(shí)施、報(bào)告工作4.驗(yàn)證進(jìn)度計(jì)劃表本次微生物限度檢查方法驗(yàn)證的計(jì)劃安排時(shí)間是12月至1月。5.驗(yàn)證所需要的儀器設(shè)備及相關(guān)文件的確認(rèn)5.1.主要檢驗(yàn)儀器設(shè)備確認(rèn)表序號儀器設(shè)備名稱型號編號校準(zhǔn)單位校準(zhǔn)日期有效期至1電子天平2生化培養(yǎng)箱3生化培養(yǎng)箱4生化培養(yǎng)箱5立式壓力蒸汽滅菌鍋6生物潔凈安全柜檢查人/日期:復(fù)核人/日期:5.2.驗(yàn)證所需文件的確認(rèn)表文件名稱文件編碼是否有效版本文件保存處《人工牛黃甲硝唑膠囊內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》□是□否質(zhì)量部《人工牛黃甲硝唑膠囊檢驗(yàn)操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《取樣操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《微生物限度檢查操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《微生物實(shí)驗(yàn)室清潔消毒操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《培養(yǎng)基的管理制度》□是□否質(zhì)量部《檢定菌的保存、傳代、使用、銷毀規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《LDZX-30FBS立式壓力壓蒸汽滅菌器操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《SPX-150B生化培養(yǎng)箱操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《BHC-1300IIA/B3生物潔凈安全柜操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部《JJ200電子天平操作規(guī)程》□是□否質(zhì)量部檢查人/日期:復(fù)核人/日期:6.驗(yàn)證所需要的菌種、培養(yǎng)基、檢驗(yàn)樣品的確認(rèn)6.1.試驗(yàn)菌種檢查表金黃色葡萄球菌CMCC(B)26003銅綠假單胞菌CMCC(B)10104枯草芽孢桿菌CMCC(B)63501白色念珠菌CMCC(F)98001黑曲霉CMCC(F)98003大腸埃希菌CMCC(B)44102乙型副傷寒沙門菌CMCC(B)50094檢查人/日期:復(fù)核人/日期:6.2試驗(yàn)所需的培養(yǎng)基檢查序號名稱生產(chǎn)廠家是否經(jīng)過培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)批號01胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否02胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否03沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否04沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否05麥康凱液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否06麥康凱瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否07RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否08木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否09三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基北京三藥科技開發(fā)公司□是□否檢查人/日期:復(fù)核人/日期:

6.3.檢驗(yàn)樣品確認(rèn)表序號品名生產(chǎn)廠家批號規(guī)格是否按GMP要求生產(chǎn)1人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否2人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否3人工牛黃甲硝唑膠囊佛山市華普生藥業(yè)有限公司甲硝唑0.2g人工牛黃5mg□是□否檢查人/日期:復(fù)核人/日期:7.驗(yàn)證項(xiàng)目和驗(yàn)證方法7.1試驗(yàn)菌株人工牛黃甲硝唑膠囊需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證所用的菌株為金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉;控制菌檢查方法驗(yàn)證所用的菌株為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌。試驗(yàn)菌株的傳代次數(shù)不得超過5代,并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。7.2需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證的菌液制備分別接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí),取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中,20～25℃培養(yǎng)2～3天,取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至沙氏葡萄糖瓊脂斜面上,20～25℃培養(yǎng)5～7天,直到獲得豐富的孢子。加入3～5ml含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫,吸至無菌試管中,取1ml加含有0.05%聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/m的孢子懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置,應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用;若保存在2～8℃,可在24小時(shí)內(nèi)使用。黑曲霉孢子懸液可保存在2～8℃,在驗(yàn)證過的貯存期內(nèi)使用。驗(yàn)證時(shí),對各試驗(yàn)菌的回收率逐一進(jìn)行驗(yàn)證。7.3.需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證--常規(guī)傾注平皿法7.3.1.供試液的制備取供試品10g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml,振搖,制成1:10的供試液。7.3.2.試驗(yàn)組取1:10的供試液1ml和7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的試驗(yàn)菌,分別注入平皿中,立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻,每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌),或培養(yǎng)5天(白色念珠菌、黑曲霉),點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。另取1:10的供試液1ml和7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉,分別注入平皿中,立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻,每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.3.3.供試品對照組取1:10的供試液1ml注入平皿中,立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻,平行制備2個(gè)平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。另取1:10的供試液1ml注入平皿中,立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻,平行制備2個(gè)平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.3.4.菌液對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的試驗(yàn)菌,分別注入平皿中,立即傾注不超過45℃的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20ml混勻,每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿。置30～35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌),或培養(yǎng)5天(白色念珠菌、黑曲霉),點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。另取0.9%無菌氯化鈉溶液1ml和7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的白色念珠菌、黑曲霉,分別注入平皿中,立即傾注不超過45℃的沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基20ml混勻,每株試驗(yàn)菌株平行制備2個(gè)平皿。置20～25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5天,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.3.5.常規(guī)傾注平皿法方法驗(yàn)證的接受標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值(即試驗(yàn)菌的回收率)應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi)。7.3.6.常規(guī)傾注平皿法方法驗(yàn)證的結(jié)果7.3.6.1.常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)1:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)2:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)3:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值金黃色葡萄球菌銅綠假單胞菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:7.3.6.2.常規(guī)傾注平皿法測定霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗(yàn)證結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)1:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)2:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)3:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:5天試驗(yàn)菌株菌種代數(shù)試驗(yàn)組供試品對照組菌液對照組試驗(yàn)菌的回收率12均值12均值12均值白色念珠菌黑曲霉試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:7.3.7.常規(guī)傾注平皿法測定需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)方法驗(yàn)證小結(jié)按照驗(yàn)證方案的要求進(jìn)行試驗(yàn),若各試驗(yàn)菌株的回收率在0.5～2范圍內(nèi),則可確認(rèn)常規(guī)傾注平皿法適用于本品的需氧菌總數(shù)、霉菌與酵母菌總數(shù)檢查。如常規(guī)傾注平皿法適用于霉菌與酵母菌總數(shù)檢查,但不適用于需氧菌總數(shù)檢查,則下面進(jìn)一步驗(yàn)證可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法是否適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。7.4.需氧菌總數(shù)檢查—離心沉淀-薄膜過濾法7.4.1.供試液的制備取供試品10g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml,振搖,制成1:10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml,經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘,取上清液得供試液。7.4.2.試驗(yàn)組取供試液1ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次(100ml/次),然后在第3次沖洗液(100ml0.9%無菌氯化鈉溶液)中加入7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的試驗(yàn)菌,過濾。每株試驗(yàn)菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上,30～35℃倒置培養(yǎng)3天(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌),或培養(yǎng)5天(白色念珠菌、黑曲霉),點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.4.3.供試品對照組取供試液1ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次(100ml/次),平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上,30～35℃倒置培養(yǎng)5天,點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.4.4.菌液對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml,200ml經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,在余下的100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中加入7.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的試驗(yàn)菌,過濾。每株試驗(yàn)菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上,30～35℃倒置培養(yǎng)3天(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌),或培養(yǎng)5天(白色念珠菌、黑曲霉),點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.4.5.稀釋劑對照組依照7.2項(xiàng)下菌液制備方法,以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液,將各菌液稀釋至含菌50～100cfu/ml,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘,取上層菌液作下面的試驗(yàn)。取上層菌液1ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次(100ml/次),每株試驗(yàn)菌株平行制備2張濾膜。取出濾膜菌面朝上貼于胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基平皿上,30～35℃倒置培養(yǎng)3天(金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌),或培養(yǎng)5天(白色念珠菌、黑曲霉),點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)。7.4.6.離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證的接受標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值(即試驗(yàn)菌的回收率)應(yīng)在0.5?2范圍內(nèi),同時(shí)稀釋劑對照組與菌液對照組菌落數(shù)的比值應(yīng)也在0.5?2范圍內(nèi)。7.4.7.離心沉淀-薄膜過濾法測定需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證的結(jié)果試驗(yàn)次數(shù)1:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)2:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天

試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)3:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:;胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基配制批號:培養(yǎng)箱型號編號;培養(yǎng)溫度:;培養(yǎng)時(shí)長:金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌3天,白色念珠菌、黑曲霉5天

試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:7.4.8.離心沉淀-薄膜過濾測定需氧菌總數(shù)方法驗(yàn)證小結(jié)按照驗(yàn)證方案的要求進(jìn)行試驗(yàn),若試驗(yàn)組各試驗(yàn)菌株的回收率在0.5～2范圍內(nèi),稀釋劑對照組各試驗(yàn)菌株的的回收率也在0.5～2范圍內(nèi),則可確認(rèn)離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的需氧菌總數(shù)檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗(yàn)證過的供試液制備方法及計(jì)數(shù)方法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。7.5.控制菌檢查方法驗(yàn)證—離心沉淀-薄膜過濾法若在7.3需氧菌總數(shù)檢查、霉菌和酵母菌總數(shù)檢查方法驗(yàn)證--常規(guī)傾注平皿法的試驗(yàn)中,證實(shí)了人工牛黃甲硝唑膠囊有抑菌性,不能使用常規(guī)傾注平皿法進(jìn)行需氧菌總數(shù)檢查,則為了確?？刂凭鷻z查的可靠性,采用可去除供試品抑菌物質(zhì)的離心沉淀-薄膜過濾法進(jìn)行控制菌檢查,按照以下方案進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。7.5.1試驗(yàn)菌株人工牛黃甲硝唑膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定檢查的控制菌為大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌,因此選擇這兩種菌株進(jìn)行控制菌檢查的方法學(xué)驗(yàn)證。試驗(yàn)菌株的傳代次數(shù)不得超過5代,并采用適宜的菌種保藏技術(shù)進(jìn)行保存,以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。7.5.2控制菌檢查方法驗(yàn)證的菌液制備分別接種大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí),取此培養(yǎng)液1ml加0.9％無菌氯化鈉溶液9ml,采用10倍遞增稀釋法,稀釋至10-5～10-7,制成50～100cfu/ml的菌懸液備用。菌液制備后若在室溫下放置,應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)使用;若保存在2～8℃,可在24小時(shí)內(nèi)使用。驗(yàn)證時(shí),對各試驗(yàn)菌的回收率逐一進(jìn)行驗(yàn)證。7.5.3大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證7.5.3.1供試液的制備取供試品10g,加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml,振搖,制成1:10的供試液貯備液。取1:10的供試液貯備液50ml,經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘,取上清液得供試液。7.5.3.2.試驗(yàn)組取供試液10ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次(100ml/次),然后在第3次沖洗液(100ml0.9%無菌氯化鈉溶液)中加入7.5.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的大腸埃希菌,過濾。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述增菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42～44℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應(yīng)有大腸埃希菌典型菌落生長。7.5.3.3陽性對照組照7.5.2項(xiàng)下菌液制備方法,以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液,將大腸埃希菌液稀釋至含菌50～100cfu/ml,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘,取上層菌液作下面的試驗(yàn)。取上層菌液1ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次(100ml/次)。取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述增菌培養(yǎng)物1ml接種至100ml麥康凱液體培養(yǎng)基中,42～44℃培養(yǎng)24～48小時(shí)。取麥康凱液體培養(yǎng)物劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃培養(yǎng)18～72小時(shí)。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板上應(yīng)有大腸埃希菌典型菌落生長。7.5.3.4陰性對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,取膜接種至100ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。陰性對照應(yīng)無菌生長。7.5.3.5離心沉淀-薄膜過濾法測定大腸埃希菌方法驗(yàn)證結(jié)果

試驗(yàn)次數(shù)1:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號(菌種編號)過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時(shí)間開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)2:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號(菌種編號)過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時(shí)間開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:

試驗(yàn)次數(shù)3:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:大腸埃希菌對照菌來源批號(菌種編號)過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱液體培養(yǎng)基配制批號麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時(shí)間開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)開始月日時(shí)結(jié)束月日時(shí)試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:7.5.3.6大腸埃希菌檢查方法驗(yàn)證結(jié)果小結(jié)按照驗(yàn)證方案的要求進(jìn)行試驗(yàn),若試驗(yàn)組與陽性對照組均檢出典型大腸埃希菌,陰性對照組無菌生長,則可確認(rèn)離心沉淀-薄膜過濾法適用于本品的大腸埃希菌檢查。人工牛黃甲硝唑膠囊照此驗(yàn)證過的供試液制備方法及大腸埃希菌檢查方法進(jìn)行檢查。7.5.4沙門菌檢查方法驗(yàn)證7.5.4.1供試液的制備取樣品10g加0.9%無菌氯化鈉溶液至100ml制成1:10的供試液。取全部供試液經(jīng)500轉(zhuǎn)/分鐘離心4分鐘,取全部上清液為供試液。7.5.4.2.試驗(yàn)組取全部供試液,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜2次(100ml/次)。然后在第3次沖洗液(100ml0.9%無菌氯化鈉溶液)中加入7.5.2項(xiàng)下制備的50～100cfu的乙型副傷寒沙門菌,過濾。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃培養(yǎng)18～48小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應(yīng)生長良好,菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落,于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)18～24小時(shí)。7.5.4.3陽性對照組照7.5.2項(xiàng)下菌液制備方法,以0.9%無菌氯化鈉為稀釋液,將乙型副傷寒沙門菌液稀釋至含菌50～100cfu/ml,然后以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3分鐘,取上層菌液作下面的試驗(yàn)。取上層菌液1ml,加至100ml0.9%無菌氯化鈉溶液中,混勻,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,以0.9%無菌氯化鈉溶液沖洗濾膜3次(100ml/次)。取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取上述增菌培養(yǎng)物0.1ml接種至10mlRV沙門增菌液體培養(yǎng)基,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取少量RV沙門菌增菌液體培養(yǎng)物劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上,30～35℃培養(yǎng)18～48小時(shí)。沙門菌在木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上應(yīng)生長良好,菌落為淡紅色或無色、透明或半透明、中心有或無黑色。用接種針挑選出木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板上的典型菌落,于三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基高層斜面上進(jìn)行斜面和高層穿刺接種,培養(yǎng)18～24小時(shí)。7.5.4.4陰性對照組取0.9%無菌氯化鈉溶液300ml,全量經(jīng)過薄膜(孔徑0.45μm混合纖維素膜)后,取膜接種至200ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中,混勻,30～35℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。陰性對照應(yīng)無菌生長。7.5.4.5離心沉淀-薄膜過濾法測定乙型副傷寒沙門菌方法驗(yàn)證結(jié)果

試驗(yàn)次數(shù)1:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:乙型副傷寒沙門菌對照菌來源批號(菌種編號)過程增菌培養(yǎng)選擇培養(yǎng)分離培養(yǎng)結(jié)果判斷培養(yǎng)基胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基配制批號RV沙門增菌液體培養(yǎng)基配制批號木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基平板配制批號三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基斜面和高層穿刺接種配制批號培養(yǎng)箱型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃型號編號溫度℃培養(yǎng)時(shí)間月日時(shí)至月日時(shí)月日時(shí)至月日時(shí)月日時(shí)至月日時(shí)月日時(shí)至月日時(shí)試驗(yàn)組陽性對照組陰性對照組試驗(yàn)人/日期:復(fù)核人/日期:試驗(yàn)次數(shù)2:人工牛黃甲硝唑膠囊批號:乙型副傷寒沙門菌對照菌來源批號(菌種編號