m法測定瑞士乳桿菌mb2-1細(xì)菌的研究

m法測定瑞士乳桿菌mb2-1細(xì)菌的研究

有很多方法可以計算微生物，例如單元稀釋法。MTT染色法是一種檢測活細(xì)胞生長與活力的方法1材料和方法1.1培養(yǎng)基和mtt染色液瑞士乳桿菌L.helveticusMB2-1本實驗室保存。8g/L乳清培養(yǎng)基、8.5g/L生理鹽水、MRS培養(yǎng)基自制;MTT染色液、DMSO北京索來寶科技有限公司;MultiskanGO全波長酶標(biāo)儀美國賽默飛世爾科技有限公司。1.2方法1.2.1細(xì)菌培養(yǎng)40℃條件下4%的接種量在乳清培養(yǎng)基中2次活化菌種后培養(yǎng)10~12h。此時培養(yǎng)液中菌體菌數(shù)約為0.5×101.2.2離心除清液條件5mL細(xì)菌液加入35mL生理鹽水中,于4℃條件下以3500r/min離心10min后去除上清液。重復(fù)此清洗過程1次后將離心所得的菌泥復(fù)溶于5mL生理鹽水中,制成懸菌液。1.2.3離心沉淀物甲蝦酶活性測定一定量的待測菌液與MTT染色液混勻后置于40℃培養(yǎng)箱中染色反應(yīng),然后在4℃條件下12000r/min高速離心10min,分離出離心沉淀物甲瓚溶解于DMSO中,取樣于96孔平底培養(yǎng)板中,采用酶標(biāo)儀測定此溶液的OD值1.2.4mtt染色計數(shù)方法條件的確定通過染色效果對比,確定最佳工作波長、相對于待測菌體液、最佳MTT染色液的加入量和最佳DMSO加入量、最佳染色時間,得到MTT染色法與平板稀釋計數(shù)法的關(guān)系標(biāo)準(zhǔn)曲線以及此標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效應(yīng)用測試范圍。2結(jié)果與分析2.1dmso溶解甲蝦的穩(wěn)定性采用MTT染色計數(shù)方法進(jìn)行細(xì)菌染色后取樣,在波長400~700nm之間進(jìn)行讀數(shù),取間隔范圍為5nm的OD值,每份樣品3個平行,結(jié)果如圖1所示。從圖1可以看出,DMSO溶解的甲瓚晶體最大吸收峰出現(xiàn)在波長510nm處。由于酶標(biāo)儀的精確度隨OD值的增大而增大,為了實驗的精確性,選擇MTT染色計數(shù)法的最佳工作波長為510nm。2.2mtt染色液加入量的確定固定MTT染色液體積,改變待測菌液的加入量使得MTT染色液的加入量與待測菌液的體積比分別為1:1.25、1:2.5、1:3.75、1:5。在工作波長500~700nm之間讀數(shù)OD值,驗證MTT染色液的加入量對最佳工作波長的影響。實驗設(shè)3個重復(fù),結(jié)果如圖2所示。從圖2可以看出,不同MTT染色液加入量對OD值的影響顯著,隨著MTT染色液加入量比例的減小,OD值上升,OD值曲線的起伏變化加大。考慮到實驗精確性,選擇MTT染色液與待測菌液的混合比例比為1:5。從圖2還可以看出,MTT染色液的加入量不影響OD值最大吸收峰,最佳工作波長仍然保持在510nm。2.3dmso最佳加入量的確定按MTT染色液與待測菌液1:5的混合比例進(jìn)行實驗,改變DMSO加入量使得待測菌液與DMSO體積比分別為1:0、1:1、1:2、1:3。在工作波長500~700nm之間進(jìn)行測定。由于高濃度菌體下以體積比1:1加入DMSO時,已出現(xiàn)甲瓚晶體溶解困難的現(xiàn)象,因此從操作的可行性考慮,本實驗不討論DMSO加入量更少的情況,設(shè)3個重復(fù)實驗,結(jié)果如圖3所示。如圖3所示,DMSO溶劑的加入量對OD值的影響顯著,DMSO溶劑加入量與所測菌液的比例為1:1時OD曲線變化加大,OD值更加顯著,可能原因為增大DMSO的加入量促進(jìn)了甲瓚的充分溶解。此外,從圖3還可以看出,DMSO加入量對吸收峰有一定的影響,當(dāng)不加入DMSO時,最佳吸收峰的位置從510nm移到了575nm波長處,并且此曲線與其他MTT染色所得曲線明顯趨勢不同。因此,選擇DMSO溶劑加入量與所測菌液的比例為1:1,此時最佳工作波長保持為510nm。2.4mtt活菌測試將待測菌液用8.5g/L的無菌鹽水分別稀釋為1:0(原樣)、1:0.25、1:0.5、1:0.75、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:16、1:32、1:64、1:128,然后進(jìn)行MTT活菌測試,每個稀釋度5個重復(fù)。同時,采用平板稀釋計數(shù)法對各稀釋度進(jìn)行活菌計數(shù)。以染色時間為變量建立3個對照組,使得其在40℃條件下染色時間分別為1、2.5、4h。用兩種活菌計數(shù)方法所得結(jié)果,以MTT法所得OD從圖4可以看出,MTT染色法所得OD2.5mtt法確定的流量范圍將經(jīng)過平板稀釋計數(shù)法確認(rèn)菌體濃度在10由表1可知,6組實驗的平均值直觀地表明了102.6mtt染色計算法的數(shù)據(jù)處理和優(yōu)化由圖4可知,3條標(biāo)準(zhǔn)曲線的R當(dāng)OD由圖6可知,當(dāng)根據(jù)OD3最佳工作條件本實驗證明MTT染色法用于MB2-1活菌計數(shù)方法是可行的。此計數(shù)方法前處理用3500r/min離心10min洗滌后收集菌體,重復(fù)2