鈣信號(hào)通路在克氏原螯蝦眼柄切除誘導(dǎo)卵巢成熟中的作用

鈣信號(hào)通路在克氏原螯蝦眼柄切除誘導(dǎo)卵巢成熟中的作用

甲殼動(dòng)物的眼睛上有一個(gè)x-器官-冬腺（x-器官-環(huán)）的綜合體。該綜合體是甲殼動(dòng)物神經(jīng)內(nèi)涵調(diào)節(jié)的中心，能分泌各種激素，如生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)化和腺體發(fā)育。但截至目前,國(guó)際上對(duì)甲殼動(dòng)物切除眼柄后體內(nèi)誘導(dǎo)性腺發(fā)育成熟的分子機(jī)制還知之甚少。2011年,Uawisetwathana等本研究借鑒上述國(guó)外最新研究結(jié)果,探討了克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)單側(cè)眼柄切除后卵巢的一系列變化情況,利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)比較分析了眼柄切除前、后卵巢組織中鈣調(diào)蛋白基因(CaM)與質(zhì)膜Ca1材料和方法1.1配套養(yǎng)殖基地試驗(yàn)用克氏原螯蝦雌蝦于2012年1月取自江蘇寶龍集團(tuán)有限公司大豐養(yǎng)殖基地。選取體質(zhì)健壯、活動(dòng)力強(qiáng)、附肢完整的克氏原螯蝦雌蝦共40尾,體長(zhǎng)為12.8～13.9cm,體重為31.2～39.1g。1.2方法1.2.1眼柄切除效果試驗(yàn)蝦于實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)7d,待其活動(dòng)和攝食都正常后采用鑷燙法切除右側(cè)眼柄。切除過(guò)程如下:將醫(yī)用中號(hào)鑷子于酒精燈上燒至發(fā)紅狀態(tài)后對(duì)準(zhǔn)雌蝦右側(cè)眼柄進(jìn)行燙傷摘除,處理時(shí)間為35s。分別于眼柄切除前(第0天)、切除后第1、7、15天隨機(jī)取10尾蝦,統(tǒng)計(jì)體長(zhǎng)、體重、卵巢重量、性腺指數(shù)(Gonadosomaticindex,GSI)等指標(biāo)。性腺指數(shù)=卵巢重量/體重×100%。1.2.2cda和ca基因檢測(cè)提取卵巢組織總RNA:活體解剖試驗(yàn)蝦,分離卵巢組織,稱重后立即采用TRIzol采用iScriptSYBRGreenOne-StepRT-PCR試劑盒(Bio-Rad,USA),運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)對(duì)各試驗(yàn)組克氏原螯蝦卵巢組織中CaM及PMCA基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)克氏原螯蝦CaM基因(GenBank登錄號(hào):FJ179169)使用的檢測(cè)引物為:5′-CAACGAAGTGGACGCTGAC-3′和5′-GGCTTCCCTGATCTCTTCCT-3′,擴(kuò)增片段大小為103bp;針對(duì)克氏原螯蝦PMCA基因(GenBank登錄號(hào):AY455931)使用的檢測(cè)引物為:5′-GCAAGTGGTGGCTGTAACTGGT-3′和5′-ATGGGCTTCAATTCTGGATATG-3′,擴(kuò)增片段大小為108bp;內(nèi)參基因18SrDNA使用的檢測(cè)引物為:5′-TGGTGCATGGCCGTTCTTA-3′和5′-AATTGCTGGAGATCCGTCGAC-3′。實(shí)時(shí)定量PCR的操作按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,反應(yīng)條件均為:95℃預(yù)變性10s;95℃變性30s,60℃退火15s,共40個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后設(shè)定閾值,利用SDS軟件V2.2版本輸出各檢測(cè)基因的C2結(jié)果與分析2.1眼柄切除前、后卵巢重量和分布特征趙維信等由表1可知,從單側(cè)眼柄切除前至切除后的第15天,克氏原螯蝦雌蝦體長(zhǎng)和體重增長(zhǎng)不顯著,體長(zhǎng)由(13.5±0.4)cm增加至(14.2±0.7)cm,體重由(35.2±3.8)g增加至(40.5±6.8)g;相反,卵巢重量增加非常顯著(P<0.05),由(0.3±0.1)g增加至(1.9±0.6)g,從而使性腺指數(shù)由(0.9±0.2)%增長(zhǎng)至(4.7±2.3)%,表明眼柄切除確實(shí)促進(jìn)了雌蝦卵巢的快速發(fā)育成熟。觀察不同時(shí)間卵巢外觀特征可見(jiàn):眼柄切除前卵巢呈白色至淺黃色,細(xì)線狀,卵粒少,無(wú)卵黃顆粒,處于發(fā)育Ⅱ期;眼柄切除后第1天卵巢呈淡黃色至黃色,線狀或條狀,出現(xiàn)卵黃顆粒,表明此時(shí)基本處于發(fā)育Ⅲ期;切除后第7天卵巢呈黃色至深褐色,棒狀,卵巢占據(jù)胸腔的1/2～3/4,卵黃顆粒大量生成,顯示此時(shí)處于發(fā)育IV期;切除后第15天卵巢呈深褐色至黑色,粗棒狀,占據(jù)整個(gè)胸腔,卵細(xì)胞圓形且飽滿,卵徑1.5mm以上,卵黃顆粒充滿整個(gè)卵細(xì)胞,表明此時(shí)卵巢已發(fā)育成熟,處于發(fā)育V期。2.2cdm患者眼柄切除前、后兩周ca、pmca基因表達(dá)水平的變化由圖1可知,克氏原螯蝦雌蝦眼柄的切除均大幅誘導(dǎo)了卵巢組織中CaM及PMCA基因表達(dá)水平的上調(diào),兩者在眼柄切除后的第1天表達(dá)水平最高,分別為眼柄切除前的8.7倍和13.2倍;隨后表達(dá)水平逐漸下降,切除后第7天CaM及PMCA基因表達(dá)水平分別為切除前的5.1倍和9.2倍;切除后第15天兩者幾乎回到了眼柄切除前的表達(dá)水平,分別僅為切除前的1.1倍和1.4倍。以上結(jié)果表明,CaM與PMCA可能主要參與眼柄切除誘導(dǎo)克氏原螯蝦卵巢成熟的早期分子過(guò)程。3卵黃蛋白物質(zhì)及代謝特征檢測(cè)結(jié)果本試驗(yàn)中克氏原螯蝦雌蝦在單側(cè)眼柄切除后第15天卵巢已呈粗棒狀,顏色為深褐色至黑色,卵巢飽滿并占據(jù)整個(gè)胸腔,卵黃顆粒大且充滿整個(gè)卵細(xì)胞,核仁可見(jiàn),表明此時(shí)卵巢已發(fā)育成熟。值得注意的是,雌蝦卵巢重量在眼柄切除后的第7天至第15天增長(zhǎng)最為顯著,由(0.8±0.3)g增長(zhǎng)至(1.9±0.6)g,表明此期間卵巢急速積累卵黃物質(zhì)(主要包括蛋白質(zhì)和脂類)。從卵巢發(fā)育成熟時(shí)間上來(lái)看,切除眼柄雌蝦比不切除眼柄雌蝦卵巢成熟時(shí)間提早2～3個(gè)月在克氏原螯蝦蝦苗人工繁育過(guò)程中,親蝦成活率低,產(chǎn)卵、孵化同步性差,育苗產(chǎn)量低等是目前制約克氏原螯蝦人工養(yǎng)殖的突出問(wèn)題CaM是細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子,介導(dǎo)調(diào)控由Ca克氏原螯蝦卵泡細(xì)胞中鈣信號(hào)通路的誘導(dǎo)激活推測(cè)是由體內(nèi)的促性腺激素釋放激素(Go