馬立克氏病病毒vp22蛋白的表達(dá)及細(xì)胞間擴(kuò)散能力的研究

馬立克氏病病毒vp22蛋白的表達(dá)及細(xì)胞間擴(kuò)散能力的研究

單帶流行病毒1號（hsv-1）由虛假基因編碼的序列x-vip2和蛋白質(zhì)誘導(dǎo)區(qū)（ptsd）引起的白介素-1家族成員。Leslie等將VP22與一段12個(gè)氨基酸殘基的多肽融合表達(dá)并轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞后發(fā)現(xiàn),融合蛋白仍能在細(xì)胞間轉(zhuǎn)運(yùn)我們曾報(bào)道過,與HSV-1UL49序列同源的MDV-1CVI988/Rispens株UL49基因編碼的VP22蛋白也具有蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能1材料和方法1.1菌株和細(xì)胞的培養(yǎng)CVI988/Rispens毒株屬血清Ⅰ型MDV弱毒株,由本實(shí)驗(yàn)室保存;E.coliJM109工程菌以及COS-1細(xì)胞均由本實(shí)驗(yàn)室保存。pcDNA-VP22載體1.2bamh酶切位點(diǎn)篩選及pcd擴(kuò)增根據(jù)GenBank公布的相關(guān)序列,設(shè)計(jì)引物如表1:為便于克隆,上述各上游引物均引入HindⅢ酶切位點(diǎn),下游均引入BamHⅠ酶切位點(diǎn),引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。分別以pcDNA-NP、pcDNA-VP2、pcDNA-BoIFN-γ、pcDNA-F為模板,擴(kuò)增不含終止子的AIV-NP、IBDV-VP2、BoIFN-γ、NDV-F等基因片段。PCR反應(yīng)體系:5μL10×PCRbuffer,25mMMgCl1.3cos-1細(xì)胞的檢測將構(gòu)建的pNP-VP22、pVP2-VP22、pBoIFN-γ-VP22、pF-VP22用QIAGEN公司質(zhì)粒純化試劑盒回收,并用LipofectinReagent按操作說明書以2μg的DNA量轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6h后去除轉(zhuǎn)染混合液,并加入含5%小牛血清及青霉素、鏈霉素各100mg的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞72h后,以丙酮乙醇固定液(3∶2)4℃,將細(xì)胞培養(yǎng)物固定5min,PBS洗滌一次,空氣干燥后按文獻(xiàn)[16]的方法利用各單抗進(jìn)行間接免疫熒光試驗(yàn)(IFA),隨后以萊卡SP2共聚焦顯微鏡觀察各融合蛋白的擴(kuò)散及細(xì)胞定位情況。各組分別設(shè)pcDNA-NP、pNP-GFP;pcDNA-BoIFN-γ、pBoIFN-γ-GFP;pcDNA-F;pcDNA-VP2為陰性對照,pcDNA-VP22、peGFP-VP222結(jié)果2.1pccda-vp2c分離質(zhì)粒dnaPCR擴(kuò)增獲得陽性目的條帶,切膠回收后HindⅢ、BamHⅠ酶切處理,并與相同酶切的pcDNA-VP22載體DNA連接后轉(zhuǎn)化JM109細(xì)菌,提取質(zhì)粒DNA,以HindⅢ、BamHⅠ酶切鑒定。獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pNP-VP22、pVP2-VP22、pBoIFN-γ-VP22、pF-VP22(見圖1)。2.2把好轉(zhuǎn)染細(xì)胞的細(xì)胞關(guān)系將pNP-VP22及pBoIFN-γ-VP22以2μg每孔的轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染24孔板中的COS-1細(xì)胞。待融合蛋白表達(dá)后IFA檢測發(fā)現(xiàn),融合表達(dá)的NP蛋白和BoIFN-γ均能向周圍細(xì)胞擴(kuò)散,而且效率較高(圖2),而單獨(dú)表達(dá)的NP及BoIFN-γ蛋白僅在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中呈現(xiàn)綠色熒光;同樣,與GFP融合表達(dá)的NP及BoIFN-γ蛋白也僅在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中呈現(xiàn)GFP自發(fā)熒光,沒有出現(xiàn)向周圍細(xì)胞擴(kuò)散的現(xiàn)象;而作為陽性對照單獨(dú)表達(dá)的VP22及GFP-VP22融合蛋白同樣呈現(xiàn)向周圍細(xì)胞擴(kuò)散的熒光染色。2.3原代地克氏原螯蝦f蛋白的表達(dá)將pF-VP22以2μg每孔的轉(zhuǎn)染量轉(zhuǎn)染24孔板中的COS-1細(xì)胞后IFA檢測,并未發(fā)現(xiàn)融合蛋白有明顯的細(xì)胞間擴(kuò)散。加大轉(zhuǎn)染劑量至6μg,72h后IFA檢測,可見融合蛋白的微弱擴(kuò)散,而單獨(dú)表達(dá)的F蛋白則僅在轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光(圖3)。為進(jìn)一步證實(shí)觀察到的細(xì)胞間擴(kuò)散現(xiàn)象并非轉(zhuǎn)染所導(dǎo)致,將pcDNA-VP22及pNP-VP22以6μg每孔的DNA量轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞,并待目的蛋白表達(dá)后(72h)胰酶消化,將消化下來的細(xì)胞加入到正常的COS-1細(xì)胞中,結(jié)果仍發(fā)現(xiàn)類似的細(xì)胞間擴(kuò)散現(xiàn)象,只是擴(kuò)散的效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如瞬時(shí)表達(dá)后的擴(kuò)散效率(圖4)。2.4免疫蛋白表達(dá)將轉(zhuǎn)染后固定的COS-1細(xì)胞先以相應(yīng)的抗NP單抗7B4、抗BoIFN-γ單抗4A3及抗F蛋白單抗1D10作為一抗,羅丹明標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗作用后,再以抗VP22單抗4E12為一抗,FITC標(biāo)記的兔抗鼠IgG為二抗作用,并以LeicaSP2共聚焦顯微鏡488nm及514nm激發(fā)光激發(fā),雙通道檢測NP-VP22、IFN-γ-VP22、F-VP22融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果如圖5,在表達(dá)F-VP22融合蛋白的孔中,熒光雙染色僅定位在最初轉(zhuǎn)染并表達(dá)的細(xì)胞胞漿中,在臨近細(xì)胞中檢測不到;而表達(dá)NP-VP22及BoIFN-γ-VP22的孔中,在臨近細(xì)胞中也能呈現(xiàn)雙染色。2.5細(xì)胞間擴(kuò)散現(xiàn)象觀察IBDVVP2蛋白與MDV-1VP22蛋白融合表達(dá)后的細(xì)胞間定位時(shí)發(fā)現(xiàn),融合蛋白并沒有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞間擴(kuò)散現(xiàn)象,而且融合蛋白的細(xì)胞定位與單獨(dú)表達(dá)的VP2蛋白相同(圖6)。將轉(zhuǎn)染的DNA量從2μg/孔增加至8μg/孔,結(jié)果仍未發(fā)現(xiàn)融合蛋白的細(xì)胞間擴(kuò)散(數(shù)據(jù)未顯示),這表明,IBDVVP2蛋白并不能被MDV-1VP22蛋白轉(zhuǎn)運(yùn),間接說明VP22蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)功能具有選擇性。3vp2c轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力本研究通過檢測MDV-1VP22的蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)功能,并利用這一功能,成功篩選出3種能在單層細(xì)胞中被MDV-1VP22轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白,證實(shí)了MDV-1VP22作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)工具的能力,同時(shí)也證實(shí)MDV-1VP22在作為蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)工具時(shí)對其所攜帶的蛋白具有選擇性。在與MDV-1VP22融合表達(dá)的4種蛋白中,AIVNP大小約40ku、BoIFN-γ大小約13ku、IBDVVP2大小約38ku、NDVF大小約45ku,其中,AIVNP與NDVF分子量均大于IBDVVP2,但卻能被MDV-1VP22轉(zhuǎn)運(yùn),而VP2卻未被轉(zhuǎn)運(yùn),暗示VP22可能并非通過分子量大小來選擇被轉(zhuǎn)運(yùn)的目的蛋白,即MDV-1VP22的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)與被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的大小無關(guān)。另外,盡管單獨(dú)的VP22轉(zhuǎn)導(dǎo)時(shí)不存在細(xì)胞類型的偏嗜性,但在對MDV-1VP22蛋白體外轉(zhuǎn)導(dǎo)的重復(fù)實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn),VP22轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的效率似乎與細(xì)胞狀態(tài)有很大關(guān)系,這一現(xiàn)象提示:VP22轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的能力可能因細(xì)胞的種類或狀態(tài)不同而有很大差別。目前,關(guān)于V